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糖基化分析的重要性及分析方法

瀏覽次數(shù):8749 發(fā)布日期:2019-8-29  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
單抗藥物是近年來發(fā)展最快的藥物品種,在整個(gè)藥物市場(chǎng)產(chǎn)值中已經(jīng)占有超過12%的份額,超過1200億美元。目前,全球已經(jīng)批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物超過了80個(gè),年銷售額增長(zhǎng)率超過30%,主要應(yīng)用于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等治療領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)各大醫(yī)藥企業(yè)也聚焦于單抗藥物的研發(fā)。
 
單克隆抗體結(jié)構(gòu)主要由Fab和Fc兩大功能區(qū)組成,在Fab段和Fc段特定的位點(diǎn)存在糖基化修飾。這些糖基化修飾發(fā)揮著極其重要的作用:能夠維持抗體的空間構(gòu)象、穩(wěn)定抗體的結(jié)構(gòu),提高藥物的熱穩(wěn)定性;糖鏈結(jié)構(gòu)還能保護(hù)抗體不受某些蛋白酶水解,延長(zhǎng)半衰期,提高藥效;Fc段的糖基化修飾還會(huì)對(duì)抗體的安全性造成影響。因此抗體的糖型檢測(cè)在產(chǎn)品質(zhì)量控制中就非常重要。
 
目前的分析方法
 
糖鏈常用的分析方法有:液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效陰離子交換色譜法。但無論是液相色譜法還是毛細(xì)管電泳法,都必須使用專用試劑進(jìn)行熒光衍生。此衍生耗時(shí)長(zhǎng)(4小時(shí))且會(huì)導(dǎo)致唾液酸丟失,不能準(zhǔn)確分析含唾液酸樣品。且也無法分析磷酸化糖及硫酸化糖。而離子色譜無需衍生,定量準(zhǔn)確,可以覆蓋分析所有糖類型。
 
離子色譜-糖分析方法
 
高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法,是目前領(lǐng)先的糖分析方法,具有無需衍生、分離度好、靈敏度高、同時(shí)適用所有糖修飾形態(tài)等諸多優(yōu)勢(shì)。
 
對(duì)于單抗藥物的復(fù)雜糖基化,離子色譜可以從三個(gè)方面給予解析:
 
1.糖鏈水平的分析——N糖圖譜測(cè)定
 
N—糖基化修飾的糖鏈可以通過肽糖苷酶F或肽糖苷酶A酶切作用,或者肼解作用從糖蛋白上釋放出來。糖鏈經(jīng)凈化后可直接進(jìn)樣,無需衍生,避免了衍生化過程中唾液酸化聚糖的結(jié)構(gòu)改變。
 
Ofatumamab的N糖圖譜
 
離子色譜還可以和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)對(duì)色譜峰的鑒別。以Q Exactive為代表的Orbitrap超高分辨率質(zhì)譜對(duì)未標(biāo)記的糖具有高靈敏度,可解析糖鏈結(jié)構(gòu)。安培檢測(cè)器、高分辨質(zhì)譜和離子色譜聯(lián)用,可同時(shí)解決糖鏈的定性和定量分析
 

 
2.單糖組成測(cè)定
 
單抗糖鏈主要由葡萄糖胺、半乳糖胺、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等單糖組成。單糖組成測(cè)定可以從基礎(chǔ)水平上對(duì)單抗的糖組成差異給出解析。
 
對(duì)于中性糖和氨基糖的分析,通常使用酸水解的方式,使蛋白中的單糖釋放。樣品水解后,直接進(jìn)樣,無需衍生
 

 
3.唾液酸的測(cè)定
 
唾液酸存在于單抗的糖鏈末端,對(duì)于單抗在生物體內(nèi)功能的發(fā)揮起著相當(dāng)重要的作用,影響藥物的有效性。唾液酸的差異,是人源抗體和其他生物抗體差異的一個(gè)指標(biāo)。唾液酸的釋放,可使用溫和酸水解或酶解。使用離子色譜分析游離的唾液酸樣品,可直接進(jìn)樣,無需衍生。不同結(jié)構(gòu)的唾液酸在CarboPac PA10色譜柱上可以得到快速高效的分離。
 

 
綜上所述,離子色譜(IC)可用于單抗藥物的聚糖圖譜分析、單糖組成分析、唾液酸測(cè)定等方面。糖型檢出覆蓋率更高,適用于復(fù)雜唾液酸修飾糖型,極大的完善和推動(dòng)了糖蛋白類藥物N-糖鏈的質(zhì)控分析。
 
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