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蛋白純化FAQs

瀏覽次數:271 發布日期:2019-7-8  來源:卡梅德生物科技(天津)有限公司

蛋白純化FAQs​

Q1:在大腸桿菌蛋白質表達系統中,可以從細胞裂解物的可溶性部分或不可溶性部分純化蛋白質嗎?

A1:我們可以從兩個組分中純化蛋白質。它將取決于客戶的實驗需求或。我們的科學家在蛋白質復性方面有很好的經驗。選擇特定的復性策略是基于蛋白質的序列及其結構特性。

 

Q2:如果使用親和標簽,是否可以在純化后把它從蛋白質中切割出來?

A2:是的,我們使用可以在純化后被切割下來并從純化的蛋白質中去除的標簽(例如,通過在基因合成過程中引入凝血酶或TEV蛋白酶切割序列-一些氨基酸可能在切割后留在蛋白質上)。

 

Q3: 固定化抗體后,第一次親和純化蛋白效果良好,但在第二輪純化過程中蛋白未能與抗體結合,是什么原因?

A3: 低pH洗脫是親和純化最常用的洗脫方法,但它可能導致某些抗體變性,從而對隨后的抗原結合產生負面影響。為了防止這種情況發生,在蛋白質純化之后,立即用中和或結合緩沖液洗滌柱子,并將其儲存在含有抗菌劑如疊氮鈉的緩沖液中,溫度為4℃。或者,使用近中性,高鹽洗脫緩沖液,如Pierce Gentle Ag/Ab Elution Buffer。

 

Q4: 純化具有半胱氨酸的抗體,應該用什么辦法呢?

A4: Sulfolink偶聯樹脂(SulfoLink Coupling Resin)或超臨界碘乙醛樹脂(UltraLink Iodoacetyl Resin)將是不錯的選擇,它們利用相同的化學反應與還原的硫醇基團反應。

 

Q5: 生物素親和純化是如何實現的?

A5: 固定化親和素、鏈霉親和素或中性親和素用于純化生物素裂解分子。這些分子與生物素的高親和力要求不可逆變性以釋放生物素本身(包括在SDS-PAGE樣品緩沖液或8M胍、pH 1.5中沸騰)。

 

Q6: 能提供一些關于蛋白純化后蛋白再折疊的建議嗎?

A6: 請閱讀下面的建議:

*保持低蛋白濃度10-50μg/ml。

*二硫鍵有助于穩定天然蛋白質;添加氧化還原對,如GSH(還原型谷胱甘肽)。

*GSSG(氧化型谷胱甘肽),其比為10:1,GSH濃度為2-5mm。這種氧化還原對有助于在折疊過程中產生破壞和建立新的S-S鍵的氧化電位。

*通過稀釋或透析緩慢去除變性劑;甘氨酸(50mM,pH 9.0,5mM EDTA)有助于溶解蛋白質。如果使用GuHCl(鹽酸胍),加入2M尿素,因為尿素也有助于穩定蛋白質折疊。

*在非常低的濃度下添加洗滌劑,例如0.1-0.5%的NP40或0.005%(V/V)Tween 20。

*包括用于穩定蛋白質的共溶劑,如甘油(5-20%)或PEG 8000或葡萄糖或蔗糖(10%)。

*某些陰離子(例如,磷酸鹽或硫酸鹽)或陽離子(例如,MES或HEPES)也具有積極作用;包括鹽并保持中性pH,例如100mM KCl,或150-500mM NaCl,2mM MgCl2

*通過添加蛋白酶抑制劑,如0.5mM PMSF、0.005-2g/mL抑肽酶、2g/mL抑肽酶或2-5g/mL亮肽素來避免蛋白質降解。

*磷酸鹽緩沖液在抗鈣時透析將導致磷酸鈣沉淀。如果隨后的腸激酶消化需要CaCl2(10mM Tris pH 8,10mM CaCl2),記得在透析完成后加入CaCl2

 

Q7: 使用相同的親和柱可以執行多少次純化?

A7: 這隨著固定化蛋白質的穩定性和所用洗脫緩沖液的類型而變化,通常可以重復使用色譜柱至少10次而不會顯著損失活性。

發布者:卡梅德生物科技(天津)有限公司
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標簽: 蛋白純化
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