微量轉(zhuǎn)錄組測序揭示TET酶在動物卵母細(xì)胞成熟和孤雌胚胎發(fā)育中的作用
瀏覽次數(shù):143 發(fā)布日期:2025-7-7
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易小結(jié)
單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)為探明哺乳動物卵母細(xì)胞早期生長分子機制提供了新機遇。此前,單細(xì)胞DNA甲基化(scBS-seq)與轉(zhuǎn)錄組測序(Smart-seq2)已揭示豬生發(fā)泡卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)控機制,闡明了減數(shù)分裂停止到恢復(fù)的分子過程(詳見:項目文章 | 單細(xì)胞DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組分析揭示豬生發(fā)泡卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)控機制)。TET家族酶在基因組去甲基化中扮演重要角色,對胚胎發(fā)育和干細(xì)胞多能性至關(guān)重要,但在豬卵母細(xì)胞中的具體功能仍需深入探究。
本研究發(fā)現(xiàn)TET家族酶(TET1、TET2、TET3)在豬卵母細(xì)胞成熟和孤雌胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Bobcat339處理通過改變5mC和5hmC水平,顯著影響卵母細(xì)胞成熟、紡錘體結(jié)構(gòu)、染色體排列及胚胎發(fā)育進(jìn)程。此外,TET酶還通過調(diào)控合子基因組激活(ZGA)及多能性相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)一步影響胚胎發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)為理解TET家族在哺乳動物胚胎發(fā)育中的功能提供了新視角。
Smart-seq2技術(shù)是本研究的核心支持,其高通量轉(zhuǎn)錄組分析揭示了Bobcat339處理后胚胎的差異表達(dá)基因及發(fā)育停滯的分子機制。該技術(shù)為深入理解胚胎發(fā)育分子過程提供了重要線索和數(shù)據(jù)支持,為后續(xù)基因功能驗證及豬生殖生物學(xué)和胚胎工程研究奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。
研究摘要
近日,湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所陳礬博士(助理研究員)為第一作者,黃濤副研究員和畢延震研究員為共同通訊,在《International Journal of Molecular Sciences》(Int. J. Mol. Sci. )期刊發(fā)表題為《TET Family Members Are Integral to Porcine Oocyte Maturation and Parthenogenetic Pre-Implantation Embryogenesis》的科研成果。研究通過使用Bobcat339(一種特異性的小分子TET家族抑制劑)處理以抑制TET酶活性,進(jìn)而觀察其對豬卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果揭示了TET家族酶在調(diào)控豬卵母細(xì)胞成熟、紡錘體結(jié)構(gòu)、染色體排列以及胚胎發(fā)育過程中5mC和5hmC水平的關(guān)鍵作用。研究闡明了TET酶在豬卵母細(xì)胞成熟和孤雌胚胎發(fā)育中的具體作用機制,為理解哺乳動物胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控提供新的視角。此外研究結(jié)果也為豬的生殖生物學(xué)和胚胎工程提供重要理論基礎(chǔ),有助于優(yōu)化豬的繁殖技術(shù)和胚胎發(fā)育調(diào)控策略。

標(biāo)題:TET Family Members Are Integral to Porcine Oocyte Maturation and Parthenogenetic Pre-Implantation Embryogenesis(TET家族成員對豬卵母細(xì)胞成熟和孤雌胚胎發(fā)育至關(guān)重要)
發(fā)表時間:2023-08-05
發(fā)表期刊:Int. J. Mol. Sci.
影響因子:IF 5.6/Q2
技術(shù)平臺:Smart-seq2等
研究方法
樣本收集:從雌豬卵巢中分離3-6 mm的卵泡,收集帶有均勻細(xì)胞質(zhì)和多層卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes, COCs)。
體外成熟(IVM):將COCs在培養(yǎng)基中培養(yǎng),添加促性腺激素(eCG和hCG)以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。
孤雌激活:去除卵丘細(xì)胞后,激活卵母細(xì)胞,激活后的卵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
Bobcat339處理:將Bobcat339溶解于DMSO中,稀釋至不同濃度(0μM、50μM、100μM、200μM、400μM),添加到成熟培養(yǎng)基中以抑制TET酶活性。
檢測方法:
免疫熒光染色:檢測5mC和5hmC水平。
qRT-PCR:用于檢測基因表達(dá)水平。
微量RNA測序(Smart-seq2):分析胚胎轉(zhuǎn)錄組的變化。
結(jié)果圖形
(1)Bobcat339處理阻斷豬卵母細(xì)胞第一極體(First Polar Body)排出
實驗中,不同濃度的Bobcat339處理顯著降低了豬卵母細(xì)胞第一極體排出率(PBE),表現(xiàn)為濃度依賴性。在200μM和400μM濃度下,PBE率顯著下降,表明Bobcat339抑制TET酶活性后,卵母細(xì)胞成熟過程受到阻礙。
圖1:Bobcat339處理抑制了豬卵母細(xì)胞成熟。
(A)對照組和經(jīng)Bobcat339處理(0、100、200和400 μM)的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)在體外培養(yǎng)24、36和44小時后的代表性圖像。對照組的卵丘細(xì)胞擴張良好,而Bobcat339處理組的卵丘細(xì)胞擴張較少且更加黏附。
(B)經(jīng)100μM、200μM和400μM Bobcat339處理后,第一極體排出(PBE)率顯著降低。
(C)對照組和經(jīng)200μM Bobcat339處理的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)44小時后的第一極體排出的代表性圖像。
(2)經(jīng)Bobcat339處理引發(fā)豬卵母細(xì)胞凋亡
通過Annexin-V-FITC染色檢測早期凋亡水平,發(fā)現(xiàn)Bobcat339處理后的卵母細(xì)胞早期凋亡率顯著增加。此外,BAX和BCL-2的mRNA水平顯著升高,BAX/BCL-2比值顯著上升,表明TET酶抑制導(dǎo)致卵母細(xì)胞早期凋亡。
圖2:Bobcat339處理誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞早期凋亡。
(A)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞的早期凋亡熒光信號。
(B)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中帶有Annexin-V信號的卵母細(xì)胞比例。
(C)qRT-PCR檢測對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞BAX、BCL-2、BAX/BCL-2的mRNA水平。
(3)Bobcat339對卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體排列的作用
使用α-tubulin染色觀察紡錘體形態(tài),結(jié)果顯示Bobcat339處理的卵母細(xì)胞紡中錘體結(jié)構(gòu)異常,染色體排列分散。與對照組相比,異常紡錘體和染色體排列比例顯著增加,表明TET酶對卵母細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體排列具有重要作用。
圖3:Bobcat339對紡錘體形態(tài)和染色體排列的影響。
(A)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞(200μM Bobcat339)的紡錘體形態(tài)和染色體排列圖像。
(B)經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中異常紡錘體比例顯著增加。
(C)經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中染色體錯位比例顯著升高。
(4)Bobcat339處理導(dǎo)致豬卵母細(xì)胞中的5mC/5hmC水平發(fā)生變化
免疫熒光染色結(jié)果顯示,Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中5hmC信號顯著降低,而5mC信號顯著增加。定量分析進(jìn)一步驗證這一結(jié)果,表明TET酶通過調(diào)節(jié)5mC和5hmC水平影響卵母細(xì)胞成熟。
圖4:Bobcat339處理改變了豬卵母細(xì)胞中的5mC和5hmC水平。
(A)豬卵母細(xì)胞中5hmC的免疫熒光染色。
(B)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中5hmC的熒光強度。
(C)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中5mC的免疫熒光染色。
(D)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的卵母細(xì)胞中5mC的平均熒光強度。
(5)Bobcat339對胚胎發(fā)育的影響
在孤雌胚胎發(fā)育實驗中,不同濃度的Bobcat339處理顯著降低了胚胎發(fā)育到囊胚階段的比例。胚胎在4細(xì)胞階段停滯,表明Bobcat339抑制TET酶活性后,胚胎發(fā)育受到嚴(yán)重影響。

圖5:Bobcat339處理抑制了豬的早期胚胎發(fā)育。
(A)對照組和經(jīng)Bobcat339處理(25、50和100 μM)的孤雌激活豬胚胎在第6天囊胚形成的圖像。
(B)對照組和經(jīng)Bobcat339處理組中發(fā)育到囊胚階段的激活卵母細(xì)胞比例。
(C)對照組和經(jīng)Bobcat339處理(25、50和100 μM Bobcat339)組中第3天不同階段的胚胎比例。
(6)Bobcat339處理降低了ZGA和多能性相關(guān)基因的表達(dá)
qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,Bobcat339處理后,合子基因組激活(zygotic gene activation,ZGA)標(biāo)記基因(如EIF1A和DPPA2)以及多能性相關(guān)基因(如OCT4和NANOG)的mRNA水平顯著下降,表明Bobcat339處理破壞了ZGA,影響胚胎發(fā)育。

圖6:Bobcat339處理阻斷了ZGA和多能性基因的表達(dá)。
(A)經(jīng)Bobcat339處理的胚胎中,EIF1A和DPPA2的mRNA水平顯著降低。
(B)經(jīng)Bobcat339處理的胚胎中,OCT4和NANOG的mRNA水平降低;SOX2的mRNA水平則沒有變化。
(C)Bobcat339處理后,H19的mRNA水平未受影響。
(7)Bobcat339處理影響豬胚胎中的5mC/5hmC水平
免疫熒光染色和定量分析顯示,Bobcat339處理的胚胎中5hmC水平顯著降低,而5mC水平顯著增加,表明TET家族酶通過調(diào)節(jié)5mC和5hmC水平影響胚胎發(fā)育。

圖7:Bobcat339處理影響豬胚胎中的5mC和5hmC水平。
(A-B) 對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎在2細(xì)胞和4細(xì)胞階段的5hmC免疫熒光染色。
(C-D) 對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎在2細(xì)胞和4細(xì)胞階段的5mC免疫熒光染色。
(E-F) 在對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎中,2細(xì)胞和4細(xì)胞階段的5hmC熒光強度。
(G-H) 在對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎中,2細(xì)胞和4細(xì)胞階段的5mC平均熒光強度。
(8)微量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比較分析
通過Smart-seq2技術(shù)對4細(xì)胞階段的胚胎進(jìn)行RNA測序分析,分析結(jié)果鑒定出Bobcat339處理后胚胎中的203個差異表達(dá)基因(DEGs),其中75個上調(diào)基因,128個下調(diào)基因。基因本體(GO)分析顯示,這些差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞增殖、細(xì)胞組分與線粒體相關(guān)以及細(xì)胞黏附分子結(jié)合等生物學(xué)過程中。

圖8:對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎之間的差異基因表達(dá)模式。
(A)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎在4細(xì)胞階段的mRNA水平的主成分分析(PCA)。
(B)對照組和經(jīng)Bobcat339處理組之間的基因表達(dá)和分布的小提琴圖。
(C)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎在4細(xì)胞階段的差異表達(dá)基因(DEGs)的分層聚類。
(D)對照組和經(jīng)Bobcat339處理的胚胎在4細(xì)胞階段DEGs火山圖。紅色(上調(diào))/綠色(下調(diào))。
(E)基因本體(GO)分析顯示DEGs在某些生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分中富集。
參考文獻(xiàn):
Chen, F.; Li, M.-G.; Hua, Z.-D.; Ren, H.-Y.; Gu, H.; Luo, A.-F.; Zhou, C.-F.; Zhu, Z.; Huang, T.; Bi, Y.-Z. TET Family Members Are Integral to Porcine Oocyte Maturation and Parthenogenetic Pre-Implantation Embryogenesis. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 12455. https://doi.org/10.3390/ijms241512455.