抗豬塞內(nèi)加谷病毒（Seneca Valley Virus, SVA）單克隆抗體在病毒檢測、致病機(jī)制研究及防控技術(shù)開發(fā)中具有關(guān)鍵作用。以下從毒株型號、抗體特性、制備方法、特異性參數(shù)及應(yīng)用場景等方面詳細(xì)闡述相關(guān)技術(shù)參數(shù)：

SVA 屬于小 RNA 病毒科，目前全球分離株均屬于單一血清型，但根據(jù) VP1 基因序列可分為不同基因型（如 Genotype 1 和 Genotype 2），代表性毒株如下：

• VP1 結(jié)構(gòu)蛋白： 
  • 構(gòu)成病毒衣殼的主要表面抗原，含中和表位（如 G-H 環(huán)、C 端高變區(qū)） 和型特異性表位，其中 G-H 環(huán)（氨基酸 150-165）為廣譜中和抗體的主要靶點。
• VP2/VP3 蛋白： 
  • 內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白，含群特異性保守表位，可用于病毒通用檢測（如 ELISA 包被抗原）。

1. 雜交瘤細(xì)胞株構(gòu)建：

   • 免疫原：重組 VP1 蛋白（如 SVV-OHIO-2014 株 VP1 的 1-300aa 片段，原核表達(dá)后純化）或滅活病毒顆粒（SVV-001 株）。
   • 融合細(xì)胞：SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠（BALB/c）的脾細(xì)胞融合，通過間接 ELISA 篩選陽性克隆，克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法（3 次）。
   • 抗體純化：Protein G 親和層析，純度＞95%，內(nèi)毒素＜0.1 EU/mg，抗體濃度 1-2 mg/mL。

2. 特異性驗證指標(biāo)：

   • 交叉反應(yīng)： 
     • 與口蹄疫病毒（FMDV）、豬水皰病病毒（SVDV）等小 RNA 病毒無交叉反應(yīng)（ELISA/IFA 驗證）。
     • 與豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬瘟病毒（CSFV）等非小 RNA 病毒無結(jié)合（Western blot 陰性）。
   • 中和活性：對同源毒株（如 SVV-OHIO-2014）的空斑減少率≥95%（抗體濃度 5 μg/mL），對異源毒株（如 SVA-CHN-2018）中和效率≥80%。

1. 雙抗體夾心 ELISA： 
   • 包被抗體：5E10 株單抗（10 μg/mL），檢測抗體：HRP 標(biāo)記的中和型單抗（1:5000 稀釋），檢測限（LOD）=1 ng/mL SVA 抗原。
2. 免疫熒光（IFA）： 
   • 抗體濃度：10 μg/mL，可識別感染 SVA 的 PK-15 細(xì)胞內(nèi)病毒抗原，熒光強(qiáng)度（MFI）＞2000，特異性熒光呈細(xì)胞質(zhì)顆粒狀分布。
3. 病毒中和試驗（VNT）： 
   • 中和型單抗（如 5E10）在 1:512 稀釋時可完全抑制 SVV-OHIO-2014 株感染，IC₅₀測定值為 1.2 ng/mL，對 Genotype 2 毒株 IC₅₀=3.5 ng/mL。

• 抗原變異監(jiān)測：通過單抗結(jié)合試驗（MABA）分析野外毒株 VP1 的抗原漂移，例如 Genotype 2 毒株 VP1 第 295 位氨基酸突變（A→V）可導(dǎo)致 3C7 株單抗結(jié)合效率下降 50%。
• 疫苗效力評價：使用中和型單抗檢測免疫豬血清中的中和抗體滴度，評估疫苗對不同基因型毒株的交叉保護(hù)能力（如 Genotype 1 疫苗對 Genotype 2 的保護(hù)率需通過 VNT 驗證）。

1. 基因型差異影響： 
   • 由于 SVA VP1 高變區(qū)存在基因型差異，建議根據(jù)目標(biāo)毒株基因型選擇單抗： 
     • 通用檢測（如臨床樣品初篩）優(yōu)先使用針對 VP1 保守區(qū)或 VP2 的廣譜單抗（如 5E10、VP2 特異性單抗）。
     • 分型研究需結(jié)合 Genotype 1/2 特異性單抗（如 3C7 株針對 Genotype 2）。
2. 檢測方法優(yōu)化： 
   • 檢測臨床樣品（如水皰液、口腔拭子）時，建議先用 VP2 群特異性單抗進(jìn)行 ELISA 初篩，再用 VP1 型特異性單抗進(jìn)行基因型鑒定。
   • 中和試驗需在含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行，以模擬體內(nèi)抗體環(huán)境，孵育時間≥48 小時。
3. 抗體保存與效價： 
   • 純化單抗需分裝保存于 - 20℃，避免反復(fù)凍融；工作液（1×PBS 稀釋）4℃可保存 2 周，效價下降≤10%。