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如何精準定量核酸濃度

瀏覽次數(shù):860 發(fā)布日期:2025-3-21  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負
一、紫外分光光度法(Nanodrop
原理:核酸的堿基(嘌呤、嘧啶)在260 nm波長處有最大紫外吸收峰,通過吸光值(A260)結(jié)合摩爾吸光系數(shù)計算濃度。DNA的換算系數(shù)為50 μg/mL,RNA為40 μg/mL。
特點
  • 操作簡便,1分鐘內(nèi)完成檢測。
  • 無法區(qū)分DNA/RNA、降解核酸及雜質(zhì),需結(jié)合A260/A280(>1.8為DNA純品,>2.0為RNA純品)評估純度。
  • 靈敏度較低(≥2 ng/μL),易受游離核苷酸干擾。
二、熒光染料法(如達遠辰光熒光計)
原理:特異性熒光染料(與目標核酸結(jié)合后發(fā)出熒光,通過熒光強度定量。例如,達遠辰光熒光計搭配賽默飛Qubit dsDNA HS染料檢測范圍為0.2–100 ng/μL。
特點
  • 靈敏度高(pg級),特異性強,可區(qū)分DNA/RNA。
  • 耗材成本相較于紫外分光法較高。
  • 適用于低濃度/珍貴樣本(如NGS文庫)。
三、實時熒光定量PCRqPCR
原理:通過熒光染料或探針實時監(jiān)測PCR擴增過程,Ct值與起始模板濃度呈線性關(guān)系,結(jié)合標準曲線定量。
特點
  • 特異性高,依賴引物/探針設(shè)計,可檢測拷貝數(shù)。
  • 操作復(fù)雜,耗時較長,需標準品確保擴增效率一致。
  • 適用于基因表達分析、病原體檢測等。
四、傳統(tǒng)化學(xué)法
  1. 定磷法
    • 原理:核酸中的磷在酸性條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成鉬藍,在650 nm處測吸光值,換算濃度。DNA/RNA含磷量分別為9.2%和9.5%。
    • 特點:靈敏度較高(1–10 μg),但易受蛋白質(zhì)干擾。
  2. 定糖法
    • 原理:核酸戊糖經(jīng)酸解生成醛類,與成色劑(如苔黑酚)反應(yīng)顯色,670 nm或595 nm測吸光值。
    • 特點:操作簡單,但特異性差,僅適用于粗略估算。
五、其他方法
  1. 毛細管電泳法
    • 原理:基于熒光染料結(jié)合核酸,通過遷移時間和峰面積定量,可評估核酸完整性(如RNA降解程度)。
    • 特點:靈敏度高(25 ng/μL),但單樣成本較高。
  2. 數(shù)字PCRdPCR
    • 原理:將樣本分割成微滴獨立擴增,統(tǒng)計陽性微滴數(shù)實現(xiàn)絕對定量,不受擴增效率影響。
    • 特點:適用于稀有突變檢測、病毒載量測定等。
選型建議
  • 常規(guī)檢測:優(yōu)先選擇紫外分光光度法​(快速便捷)或Qubit熒光法​(高靈敏度)。
  • 復(fù)雜樣本:如NGS文庫,推薦毛細管電泳數(shù)字PCR
絕對定量需求:使用qPCR數(shù)字PCR
發(fā)布者:深圳達遠辰光科技有限公司
聯(lián)系電話:0755-86727654
E-mail:marketing@longlightech.com

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