基于近紅外光激發(fā)的多光子吸收效應(yīng)的多光子熒光成像以特有的深穿透、高時(shí)空分辨、高信噪比和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，在生物成像，尤其是在活體深層組織成像中被廣泛應(yīng)用。相比傳統(tǒng)單光子生物成像中使用的紫外可見(jiàn)光光源，近紅外光的引入極大地提高了多光子熒光成像的穿透深度。近些年來(lái)，位于近紅外二區(qū)的光源由于在生物組織中具有更小散射和更大的穿透能力，在單光子和多光子熒光成像中均受到廣泛關(guān)注和研究，進(jìn)一步提高了生物成像的深度。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)熒光顯微成像的局限
熒光顯微技術(shù)自誕生以來(lái)，一直是生物醫(yī)學(xué)研究的核心工具。通過(guò)熒光染料標(biāo)記，科學(xué)家得以觀(guān)察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)。然而，傳統(tǒng)單光子熒光成像依賴(lài)紫外或可見(jiàn)光作為激發(fā)光源，這些波段的光極易被生物組織中的血紅蛋白、黑色素等分子吸收，導(dǎo)致穿透深度不足。即便采用最先進(jìn)的物鏡和探測(cè)技術(shù)，共聚焦顯微鏡在活體深層組織成像中仍力不從心。這種局限性嚴(yán)重制約了腦科學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域?qū)�活體動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究需求。

近紅外二區(qū)的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)
近紅外光在生物組織成像中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，根據(jù)其在組織中的傳播特性，可分為近紅外一區(qū)（NIR-Ⅰ，700-950nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000-1700nm）。近紅外二區(qū)的光在生物組織中具有更小的散射和更大的穿透能力，是更優(yōu)的“組織光學(xué)窗口”，其衰減長(zhǎng)度比近紅外一區(qū)更長(zhǎng)，在多光子熒光成像中能夠?qū)崿F(xiàn)更深的成像深度。目前近紅外二區(qū)激發(fā)的多光子熒光成像技術(shù)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。現(xiàn)有的具有紅光吸收的染料在近紅外二區(qū)的多光子吸收能力（吸收截面）相對(duì)較小，熒光量子產(chǎn)率也較低。此外，許多熒光染料的三光子吸收截面過(guò)小，激發(fā)效率低，需要更高的激發(fā)功率，這又可能導(dǎo)致生物組織的熱損傷，在神經(jīng)元成像中尤為明顯。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
成像原理的革新
多光子熒光成像基于熒光染料分子吸收多個(gè)近紅外光子后被激發(fā)并發(fā)射熒光的原理。在單光子熒光成像中，一個(gè)熒光染料分子吸收一個(gè)光子從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)，再通過(guò)內(nèi)部轉(zhuǎn)換回到基態(tài)并發(fā)射熒光，發(fā)射光波長(zhǎng)大于激發(fā)光。而在多光子激發(fā)中，染料分子在短時(shí)間內(nèi)吸收兩個(gè)或三個(gè)光子，吸收的光子能量之和接近單光子激發(fā)所需能量時(shí)，分子也會(huì)被激發(fā)發(fā)射熒光。由于能量關(guān)系，多光子激發(fā)的光波段紅移至近紅外波段。

多光子激發(fā)是一個(gè)非線(xiàn)性過(guò)程，雙光子吸收激發(fā)出的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度的二次方成正比，三光子吸收則與三次方成正比，這種特性使得多光子熒光成像僅在聚焦點(diǎn)處產(chǎn)生熒光，克服了離焦信號(hào)的干擾，具備了三維層析成像能力，這是與單光子熒光成像的主要區(qū)別之一。

多領(lǐng)域前沿應(yīng)用
在腦科學(xué)研究中，該技術(shù)可用于大深度腦血管網(wǎng)絡(luò)成像和腦神經(jīng)成像。在腦血管網(wǎng)絡(luò)成像方面，研究人員利用近紅外二區(qū)光源激發(fā)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠深層腦區(qū)微細(xì)血管結(jié)構(gòu)的清晰成像。在腦神經(jīng)成像中，多光子熒光成像技術(shù)憑借其細(xì)胞級(jí)分辨率和活體深腦區(qū)三維成像能力，被廣泛應(yīng)用于活體腦神經(jīng)元的形貌和活動(dòng)監(jiān)測(cè)。此外，研究人員還通過(guò)優(yōu)化成像系統(tǒng)的光學(xué)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)深腦區(qū)的亞細(xì)胞分辨神經(jīng)功能成像，為腦科學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持。

在經(jīng)顱成像研究中，傳統(tǒng)的成像在進(jìn)行腦成像時(shí)，需要去除或打磨顱骨，這會(huì)對(duì)生物組織造成侵入性影響。而近紅外二區(qū)光源穿透能力更強(qiáng)，有望實(shí)現(xiàn)無(wú)損的經(jīng)顱腦成像。Wang團(tuán)隊(duì)證明：1320 nm三光子激發(fā)可穿透完整顱骨，對(duì)皮層下的神經(jīng)元進(jìn)行無(wú)損成像，還實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠腦皮層血管網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)顱三光子熒光成像，并測(cè)試了血流速度，可進(jìn)一步提高穿透能力和成像深度。

在腫瘤和心血管疾病研究中，多光子成像技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。在腫瘤研究方面，通過(guò)標(biāo)記腫瘤血管或利用腫瘤組織與正常組織內(nèi)源性熒光團(tuán)的差異，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的高分辨成像。在心血管疾病研究中，脂質(zhì)在代謝類(lèi)疾病中扮演著重要角色，但目前在動(dòng)物活體水平研究脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)發(fā)展面臨挑戰(zhàn)。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
腦血管成像
以Kobat等人的實(shí)驗(yàn)為例，成功實(shí)現(xiàn)了1.6mm深度的小鼠腦活體血管網(wǎng)絡(luò)雙光子熒光成像。在成像過(guò)程中，為保證圖像信噪比，在腦皮層0.7mm深度以上區(qū)域，激發(fā)光功率隨成像深度增加而逐漸增加。這一實(shí)驗(yàn)成果證實(shí)了近紅外二區(qū)光源在深層腦結(jié)構(gòu)多光子熒光成像中的巨大優(yōu)勢(shì)。

Horton等人的實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了三光子熒光腦成像，成像深度達(dá)到1300μm。在成像深度800μm以上區(qū)域，每幀圖像采集時(shí)間約為8s，超過(guò)800μm后將激光器功率開(kāi)到最大，采集時(shí)間增加至20s。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在深度超過(guò)1000μm甚至達(dá)到1300μm時(shí)，腦血管的三光子熒光信號(hào)依然能夠被采集到并形成圖像，在1000-1135μm的腦區(qū)，三光子熒光圖像的信噪比為79-119。

Liu等人實(shí)現(xiàn)了深度達(dá)2100μm的腦血管網(wǎng)絡(luò)三光子成像。量子點(diǎn)具有穩(wěn)定、熒光光譜窄且明亮的特點(diǎn)，在成像過(guò)程中，大深度高速的三光子熒光成像在1700nm激發(fā)下能夠?qū)崿F(xiàn)高效的三光子熒光發(fā)射。

腦神經(jīng)成像
Ouzounov等人實(shí)現(xiàn)了海馬區(qū)超過(guò)1mm深度的神經(jīng)元三光子熒光成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以高信噪比的三光子熒光圖清晰地揭示了在距離大腦表面約1mm位置處的海馬區(qū)錐體層的神經(jīng)元的典型蜂窩狀排列，同時(shí)以8.49Hz的頻率記錄了約150個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)，長(zhǎng)達(dá)48min。

Horton等人實(shí)現(xiàn)了三光子熒光成像。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然1700nm激發(fā)下熒光信號(hào)較弱，但通過(guò)調(diào)整積分時(shí)間等參數(shù)，仍可實(shí)現(xiàn)較深的成像深度。Miller等人在整個(gè)成像過(guò)程中，不同腦區(qū)深度采用平均多張圖像的方式來(lái)保證成像信噪比，隨著成像深度增加，熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)元信號(hào)逐漸減弱，需要增加成像幀數(shù)或提高積分時(shí)間，這在一定程度上降低了成像速度。

Wang等人實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠顱骨內(nèi)骨細(xì)胞的三次諧波成像，探測(cè)到的顱骨厚度為140μm，顱骨下大腦皮層150μm內(nèi)的血管和神經(jīng)元樹(shù)突也被激發(fā)出較強(qiáng)的三次諧波信號(hào)。同時(shí)，利用染料對(duì)顱骨染色后，對(duì)顱骨內(nèi)骨細(xì)胞的三次諧波和三光子熒光成像揭示了“三明治”式的結(jié)構(gòu)特征，表明近紅外二區(qū)光源在腦顱骨中具有較好的穿透能力。

在心血管疾病方面，Wang等人在1200nm激發(fā)下，三光子熒光成像實(shí)現(xiàn)大深度活體脂質(zhì)成像，相比雙光子成像，信噪比和成像深度更優(yōu)，證明活體標(biāo)記脂質(zhì)的可行性及三光子熒光成像在監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展中的優(yōu)勢(shì)。

總結(jié)與展望
在腦科學(xué)、腫瘤和心血管疾病研究中提供了關(guān)鍵的成像數(shù)據(jù)，助力深入探究疾病機(jī)制，為診斷和治療奠定基礎(chǔ)。但目前該技術(shù)存在熒光染料性能欠佳、激發(fā)效率低等問(wèn)題。為此，科研人員正積極研發(fā)新型熒光染料，改進(jìn)激發(fā)光源和成像系統(tǒng)。未來(lái)，該技術(shù)有望大幅提升成像質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)雙光子與三光子成像的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，還將與人工智能、光聲成像等前沿技術(shù)融合，拓展應(yīng)用邊界。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。

王少偉, 雷銘. 近紅外二區(qū)激發(fā)多光子熒光成像[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2022, 59(6): 0617002.

DOI:10.3788/LOP202259.0617002.