在細胞基質疫苗應用領域，BHK細胞是常用的哺乳動物細胞系之一，其原始細胞株屬于貼壁依賴性生長類型，經馴化后可懸浮生長^[1]。懸浮細胞更容易實現(xiàn)工藝放大，另外無血清培養(yǎng)基可提高疫苗產品的穩(wěn)定性和安全性并降低生產成本^[2]。本文主要通過 CloudReady^®云平臺生物反應器建立BHK細胞無血清全懸浮培養(yǎng)工藝，為疫苗的高效及低成本生產提供工藝研究基礎。

方法與結果

反應器：CloudReady^®（500 mL）云平臺生物反應器
工作體積：300 mL
細胞：BHK（Baby Hamster Syrian Kidney）細胞
接種密度：4.5×10⁵ cells/mL
溫度控制：由半導體Peltier模塊的加熱和制冷實現(xiàn)無水控溫。
DO控制：由氧氣的通氣速率級聯(lián)控制，空氣恒通0.008 vvm（2.4 mL/min）。
pH控制：由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級聯(lián)控制。
進氣模式：底部通氣。

圖1 使用CloudReady^®進行BHK細胞無血清懸浮培養(yǎng)

本次實驗工藝參數(shù)設置如表1所示。

表1 反應器工藝參數(shù)

Day 0 ~ Day 5細胞密度及活率變化如圖2所示，最高活細胞密度（VCD）為1.56×10⁷ cells/mL，前期活率維持在98%以上。

圖2 細胞密度及活率變化曲線

在整個培養(yǎng)周期中，葡萄糖和乳酸濃度變化如圖3所示，谷氨酰胺和銨離子濃度及滲透壓變化如圖4所示。

圖3 葡萄糖和乳酸濃度變化曲線
圖4 谷氨酰胺和銨離子濃度及滲透壓變化曲線

隨著BHK細胞的生長增殖，代謝產生大量乳酸，為維持pH值的恒定流加了大量堿液，另外補料和細胞代謝過程也導致體系滲透壓偏高，Day 5檢測上清液滲透壓值為398 mOsm，這也是后期細胞活率降低的原因之一。

由Day 5取樣鏡檢圖像（圖5）可見，BHK細胞高密度水平下仍保持單細胞均勻懸浮狀態(tài)，未出現(xiàn)結團聚集等現(xiàn)象。

圖5 Day 5取樣鏡檢圖

結論

本次實驗結果顯示，使用CloudReady^®進行BHK細胞無血清懸浮培養(yǎng)，最高活細胞密度（VCD）可達1.56×10⁷ cells/mL，前期活率維持在98%以上且細胞在高密度水平下仍可保持均勻懸浮狀態(tài)。驗證了高通量微小型生物反應器在疫苗工藝開發(fā)與優(yōu)化方面應用的優(yōu)勢和適配性。

[1] Park S, Kim JY, Ryu KH, Kim AY, Kim J, Ko YJ, Lee EG. Production of a Foot-and-Mouth Disease Vaccine Antigen Using Suspension-Adapted BHK-21 Cells in a Bioreactor. Vaccines (Basel). 2021, 9(5): 505.

[2] Moreira J., Alves P., Feliciano A., Aunins J., Carrondo M. Serum-free and serum-containing media for growth of suspended BHK aggregates in stirred vessels. Enzyme and Microbial Technology. 1995, 17: 437–444.

關于CloudReady^®

CloudReady^®云平臺生物反應器具有高度的自動化和穩(wěn)定性，可確保工藝可重復；支持4×N臺控制器無限制拓展，還可兼容Endura SUB^®一次性罐體。

適用于各種貼壁及懸浮哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝的開發(fā)與優(yōu)化，支持批次、補料、灌流等多種培養(yǎng)工藝。

圖6 CloudReady^®（500mL，一次性罐體,16聯(lián)）

反應器配套D2MS（Data & Device Management System 設備與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)），支持設備和數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析；用戶和項目管理；DoE實驗設計；APC(高級過程控制)；UDF(用戶定義函數(shù)）；遠程監(jiān)看和控制等多種功能。

圖7 D2MS（Data & Device Management System ）設備與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)

自研反應器放大計算軟件（圖8）可基于不同放大準則一鍵計算工藝參數(shù)，助力生物制品的快速工藝放大。

圖8 迪必爾生物 反應器放大計算軟件

應用技術與工程研究中心（CARE） 張君軒  供稿