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貼壁細胞和懸浮細胞的復蘇、傳代、凍存等培養(yǎng)步驟及要點

瀏覽次數(shù):4786 發(fā)布日期:2024-4-16  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

根據(jù)細胞在瓶、皿等容器中,是否能貼附在支持物上生長的特性,可分為貼附型和懸浮型兩大類。活體體內(nèi)的細胞離體后在體外培養(yǎng)大多數(shù)以貼壁的方式生長,主要包括一些正常細胞和腫瘤細胞,比如成纖維細胞,骨骼組織(骨及軟骨),心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚神經(jīng)膠質(zhì)細胞,內(nèi)分泌細胞,黑色素細胞及腫瘤細胞等。貼壁細胞在體外培養(yǎng)中,形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些特征,多呈上皮樣或成纖維細胞樣。少數(shù)離體細胞在體外培養(yǎng)時則是懸浮生長,主要包括一些取自血、脾臟或骨髓等的細胞。
 

復蘇

凍存細胞較脆弱,要輕柔操作。一般采用快速融化原則復蘇細胞,以保證細胞外結(jié)晶快速融化,避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi),再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。


操作步驟:

1.從液氮罐或-80℃冰箱中取出凍存管,放入37℃水浴鍋中解凍,并不時搖動(注意管口處高于水面,以免水進入導致污染),整個過程最好在1min以內(nèi);

2.將凍存細胞加入到含有5-10ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,上下吹打數(shù)次,使凍存液與完全培養(yǎng)基充分混勻(若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養(yǎng)基,然后加入完全生長培養(yǎng)基中);

3.800-1000 rpm離心2-3min;

4.棄上清,用完全培養(yǎng)基重懸細胞,并進行活細胞計數(shù);

5.細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,接種濃度10^6 /ml,置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),定時觀察細胞培養(yǎng)情況(貼壁細胞復蘇24h,若密度達到80%,則正常傳代;若密度不到80%則繼續(xù)培養(yǎng)到48小時再換液;懸浮細胞復蘇3天內(nèi)不建議離心換液。)。

 

細胞復蘇操作示意圖


傳代

一、 貼壁細胞傳代操作步驟

1.用移液管或者巴氏吸管吸取培養(yǎng)液;

2.使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液(PBS)沖洗細胞1-2次;

3.棄PBS,加入胰蛋白酶-EDTA消化液(消化液濃度根據(jù)各細胞不同有調(diào)整),輕輕搖晃培養(yǎng)瓶,使胰酶與細胞表面充分接觸,37 ℃孵育2-3 min,加入含血清完全培養(yǎng)基終止消化。

4.將細胞懸液移入離心管中,800 rpm-1000rpm離心5min,棄上清,加入預熱的完全培養(yǎng)基重懸細胞,輕輕吸打混勻,吹打過程中盡量不要出現(xiàn)氣泡。

5.細胞計數(shù),根據(jù)細胞量選擇合適的傳代比例,最后轉(zhuǎn)移置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。


二、 懸浮細胞傳代操作步驟

懸浮細胞由于本身在生長培養(yǎng)基中懸浮,無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離,整個過程較為迅速,對細胞損傷較小。懸浮細胞傳代,通常有兩種方法,直接傳代法和離心傳代法。

(1)直接傳代法

① 懸浮細胞長滿至80%-90%左右(細胞懸液變黃,最大細胞密度隨細胞系不同而有所差異),即可傳代;

② 用吸管吸棄細胞懸液1/2~2/3;

③ 加入適量的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)離心傳代法

① 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi);

② 800 rpm-1000rpm離心5min,棄上清;

③ 使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞;

④ 吸管吸取適量細胞懸液,裝入新的培養(yǎng)瓶,再加入適量的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。

 

貼壁細胞與懸浮細胞培養(yǎng)比較


凍存

細胞凍存是指將細胞放在低溫環(huán)境,以達到減少細胞代謝的作用,從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的,以供后續(xù)實驗或臨床使用。細胞凍存一般采用慢凍原則,慢凍可使細胞逐步脫水,細胞不會因為產(chǎn)生大的冰晶而收到損害。


一、原理

當溫度低至-70℃時,細胞內(nèi)的代謝活動及酶活性幾乎全部停止,低于-130℃時,細胞能達到最佳存活率。液氮可實現(xiàn)細胞的長期保存。

冷凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)能快速穿透細胞膜進入細胞,降低冰點,延緩凍存過程,同時增加細胞膜的通透性,提高細胞內(nèi)離子濃度,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而達到保護細胞的目的。


二,貼壁細胞凍存操作步驟

1.預熱凍存液;

2.用PBS沖洗細胞,加入胰酶消化(此步驟同細胞傳代操作);

3.終止消化后,重懸細胞,轉(zhuǎn)移至無菌EP管,1000rpm離心5min;

4.棄上清,加入預熱的細胞凍存液,細胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml,一般不低于5×10^5/ml;

5.分裝完畢后,擰緊凍存管蓋并做好標記;

6.將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒,放入-80℃冰箱過夜;

7.將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。


三、懸浮細胞凍存操作步驟

1.用移液管將細胞懸液吹吸均勻,將細胞懸液移入離心管;

2.1000rpm離心 3 min,收集細胞沉淀;

3.用預熱的凍存液重懸細胞,細胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml,一般不低于5×10^5/ml;

4.分裝完畢后,擰緊凍存管蓋并做好標記;

5.將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒,放入-80℃冰箱過夜;

6.將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

 

貼壁細胞凍存操作示意圖


注意事項

① 細胞培養(yǎng)、傳代以及凍存需要嚴格的無菌操作。

② 傳代時需要適度的消化,消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化,一旦胞質(zhì)回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

③ 傳代應在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行。

④ 細胞凍存液需提前配制,不可直接將DMSO加入細胞懸液中。

⑤ 應選擇匯合度80%-90%左右,并且活力達90%以上處于對數(shù)生長期時的細胞進行凍存操作,確保細胞凍存時狀態(tài)最佳,凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調(diào)整。

⑥ 程序凍存盒、細胞凍存液、完全培養(yǎng)基等試劑都要復溫至室溫備用。

⑦ 凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長,以免造成細胞損傷。

⑧ 凍存管的蓋子一定要擰緊,否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。

⑨ 細胞不可長期保存在-80℃冰箱中,放置時間不要超過3天。

⑩ 液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

以上是小恒為大家總結(jié)的貼壁細胞和懸浮細胞的培養(yǎng)步驟及要點,希望能給大家提供幫助。

 

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物(Trypsin Like Enzyme),是一種通過生物工程制備的非動物源性重組蛋白酶,與胰蛋白酶有相似的解離動力學,穩(wěn)定性更高,純度更好,消化更溫和,細胞毒性更低。目前主要應用于細胞培養(yǎng)中,可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵,可以替代豬或牛胰蛋白酶(Trypsin)對貼壁細胞的消化解離。生物制藥中,GMP級別的TrypLUS能夠為疫苗生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)提供高質(zhì)量和高性價比的貼壁細胞消化解決方案。

 

 

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