根據(jù)細胞在瓶、皿等容器中，是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。活體體內(nèi)的細胞離體后在體外培養(yǎng)大多數(shù)以貼壁的方式生長，主要包括一些正常細胞和腫瘤細胞，比如成纖維細胞，骨骼組織（骨及軟骨），心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚神經(jīng)膠質(zhì)細胞，內(nèi)分泌細胞，黑色素細胞及腫瘤細胞等。貼壁細胞在體外培養(yǎng)中，形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細胞樣。少數(shù)離體細胞在體外培養(yǎng)時則是懸浮生長，主要包括一些取自血、脾臟或骨髓等的細胞。
 

復蘇

凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。一般采用快速融化原則復蘇細胞，以保證細胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。

操作步驟：

1.從液氮罐或-80℃冰箱中取出凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，并不時搖動（注意管口處高于水面，以免水進入導致污染），整個過程最好在1min以內(nèi)；

2.將凍存細胞加入到含有5-10ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，上下吹打數(shù)次，使凍存液與完全培養(yǎng)基充分混勻（若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入完全生長培養(yǎng)基中）；

3.800-1000 rpm離心2-3min；

4.棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，并進行活細胞計數(shù)；

5.細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，接種濃度10^6 /ml，置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，定時觀察細胞培養(yǎng)情況（貼壁細胞復蘇24h，若密度達到80%，則正常傳代；若密度不到80%則繼續(xù)培養(yǎng)到48小時再換液；懸浮細胞復蘇3天內(nèi)不建議離心換液。）。

 

細胞復蘇操作示意圖

傳代

一、 貼壁細胞傳代操作步驟

1.用移液管或者巴氏吸管吸取培養(yǎng)液；

2.使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞1-2次；

3.棄PBS，加入胰蛋白酶-EDTA消化液（消化液濃度根據(jù)各細胞不同有調(diào)整），輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使胰酶與細胞表面充分接觸，37 ℃孵育2-3 min，加入含血清完全培養(yǎng)基終止消化。

4.將細胞懸液移入離心管中，800 rpm-1000rpm離心5min，棄上清，加入預熱的完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕吸打混勻，吹打過程中盡量不要出現(xiàn)氣泡。

5.細胞計數(shù)，根據(jù)細胞量選擇合適的傳代比例，最后轉(zhuǎn)移置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

二、 懸浮細胞傳代操作步驟

懸浮細胞由于本身在生長培養(yǎng)基中懸浮，無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個過程較為迅速，對細胞損傷較小。懸浮細胞傳代，通常有兩種方法，直接傳代法和離心傳代法。

（1）直接傳代法

①　懸浮細胞長滿至80%-90%左右（細胞懸液變黃，最大細胞密度隨細胞系不同而有所差異），即可傳代；

②　用吸管吸棄細胞懸液1/2～2/3；

③　加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

（2）離心傳代法

①　將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)；

②　800 rpm-1000rpm離心5min，棄上清；

③　使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞；

④　吸管吸取適量細胞懸液，裝入新的培養(yǎng)瓶，再加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

 

貼壁細胞與懸浮細胞培養(yǎng)比較

凍存

細胞凍存是指將細胞放在低溫環(huán)境，以達到減少細胞代謝的作用，從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的，以供后續(xù)實驗或臨床使用。細胞凍存一般采用慢凍原則，慢凍可使細胞逐步脫水，細胞不會因為產(chǎn)生大的冰晶而收到損害。

一、原理

當溫度低至-70℃時，細胞內(nèi)的代謝活動及酶活性幾乎全部停止，低于-130℃時，細胞能達到最佳存活率。液氮可實現(xiàn)細胞的長期保存。

冷凍保護劑二甲基亞砜（DMSO）能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內(nèi)離子濃度，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。

二，貼壁細胞凍存操作步驟

1.預熱凍存液；

2.用PBS沖洗細胞，加入胰酶消化（此步驟同細胞傳代操作）；

3.終止消化后，重懸細胞，轉(zhuǎn)移至無菌EP管，1000rpm離心5min；

4.棄上清，加入預熱的細胞凍存液，細胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5.分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；

6.將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

7.將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

三、懸浮細胞凍存操作步驟

1.用移液管將細胞懸液吹吸均勻，將細胞懸液移入離心管；

2.1000rpm離心 3 min，收集細胞沉淀；

3.用預熱的凍存液重懸細胞，細胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；

4.分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；

5.將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

6.將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

 

貼壁細胞凍存操作示意圖

注意事項

①　細胞培養(yǎng)、傳代以及凍存需要嚴格的無菌操作。

②　傳代時需要適度的消化，消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

③　傳代應在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行。

④　細胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中。

⑤　應選擇匯合度80%-90%左右，并且活力達90%以上處于對數(shù)生長期時的細胞進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調(diào)整。

⑥　程序凍存盒、細胞凍存液、完全培養(yǎng)基等試劑都要復溫至室溫備用。

⑦　凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長，以免造成細胞損傷。

⑧　凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。

⑨　細胞不可長期保存在-80℃冰箱中，放置時間不要超過3天。

⑩　液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

以上是小恒為大家總結(jié)的貼壁細胞和懸浮細胞的培養(yǎng)步驟及要點，希望能給大家提供幫助。

 

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物（Trypsin Like Enzyme），是一種通過生物工程制備的非動物源性重組蛋白酶，與胰蛋白酶有相似的解離動力學，穩(wěn)定性更高，純度更好，消化更溫和，細胞毒性更低。目前主要應用于細胞培養(yǎng)中，可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵，可以替代豬或牛胰蛋白酶（Trypsin）對貼壁細胞的消化解離。生物制藥中，GMP級別的TrypLUS能夠為疫苗生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)提供高質(zhì)量和高性價比的貼壁細胞消化解決方案。