關于細胞培養中的“無菌技術”

關于細胞房管理制度的建議：

 

● 所有使用人員要嚴格按照無菌標準進行操作，保持實驗室清潔。

● 初次進入細胞房的人員，不可獨立使用細胞房。

● 所有使用人員不得在細胞房內開展與細胞培養無關的實驗。

● 嚴禁將可能含有污染物或病原菌的實驗物品帶入實驗室。

● 定期進行實驗室清潔，所有使用人員積極做好日常維護工作。

 

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無菌 VS 消毒

無菌：

是滅菌的結果，指用物理或化學方法使存在于產品中的所有微生物（包括最耐熱的細菌芽孢）失去活性，使它不能有生存和繁殖的機會（絕對無菌）。

消毒：

殺滅或清除傳播媒介上病原微生物，使其達到無害化的處理（不一定殺滅芽孢）。

 

無菌技術：

是指在醫療、護理操作中，防止一切微生物侵入人體和防止無菌物品、無菌區域被污染的操作技術。

 

目的：

• 防止一切微生物侵入機體。

• 保持無菌物品及無菌區域不被污染。

• 使已使用的無菌物品保持無菌狀態和有效時間。

 

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細胞房區域的無菌介紹
 

常規細胞房的構造含有無菌操作區、孵育區、制備區、清洗消毒滅菌區和儲藏區。

 

1、無菌操作區：只限于細胞培養及其他無菌操作，最好能與外界隔離，不能受到穿行或受其他干擾。一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。

更衣間：用于更換實驗服，鞋子及穿戴帽子、口罩、手套。

緩沖間：位于更衣間與操作間之間。目的是為了保證操作間的無菌環境，同時可放置細胞培養箱及某些必需的小型儀器。

無菌操作間：專用于無菌操作、細胞培養。

2、孵育區：孵育區對無菌的要求較低點，但仍需要保持清潔無塵。減少外界干擾和穿行的區域。

3、試劑準備區：主要進行培養液及有關培養用的液體制備。

4、清洗消毒滅菌區：主要進行所有細胞培養過程使用的器具清洗、準備、消毒及三蒸水制備等工作。

5、儲藏區：主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養液、培養瓶等設備。此環境需要清潔無塵。

 

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實驗室常見的滅菌方法
 

根據滅菌對象不同，滅菌的方法不同

1、高壓蒸汽滅菌

● 適用于藥品、容器、培養基（細菌類）、無菌衣及其他遇高溫和潮濕不發生變化或損壞的物品。

● 過程：100kpa 121℃ 20min。

● 利用高壓蒸汽以及在蒸汽環境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質凝固變性而使微生物死亡。

缺點：如對培養基或液體溶液滅菌，滅菌的時間與樣本體積有關，時間不足達不到滅菌效果，時間過長會影響樣本內的物質活性。

2、干熱滅菌

● 適用于耐高溫、干燥的物品，玻璃器皿和金屬用具等。

● 過程：120-150℃，90-120min，殺死細菌和芽孢。

● 主要適用于不便在高壓蒸汽滅菌器中滅菌，且不易被高溫損壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。

缺點：適用性不強。

3、射線滅菌法

● 適合于實驗室空氣、地面、操作臺面滅菌。

● 利用紫外線燈進行照射滅菌方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機制就是通過對微生物的核酸及蛋白質等的破壞作用而使其滅活。

缺點：紫外線殺菌效果一般，對培養物和一些試劑會產生不良影響。

4、過濾除菌法

● 適用于血清、細胞培養基等熱不穩定的生物制品及空氣的除菌。

● 將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌的方法。

缺點：過濾法除菌大多用于遇熱易發生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養液等。

5、化學滅菌法

指用化學藥品來殺滅微生物的方法。同一種化學藥品的低濃度時呈現抑菌作用，而在高濃度時則能起殺菌作用。

殺菌機理：能使微生物蛋白質變性死亡，或與酶系統結合影響代謝，或改變膜壁通透性使微生物死亡等。

● 消毒劑消毒法

消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢，能控制一定范圍的無菌狀態。常用于物體表面滅菌，但要注意消毒液濃度不宜過高，以防止化學腐蝕作用。

● 化學氣體滅菌法

指利用化學藥品的氣體或產生的蒸汽進行殺滅微生物的方法。

環氧乙烷滅菌法：傳統的滅菌法，可應用于工衣滅菌，不耐加熱滅菌的藥品、醫用器具、設施、設備等滅菌。重要影響因素：溫度、濕度、氣體濃度、滅菌時間。

● 甲醛等蒸汽熏蒸法

采用甲醛、丙二醇或過氧醋酸等化學品，通過加熱產生蒸汽進行空氣環境滅菌。

● 臭氧消毒法

臭氧在常溫、常壓下分子結構不穩定，很快自行分解成氧分子和單個氧原子，后者具有很強的活性，對細胞有極強的氧化作用，臭氧氧化分解了細菌內部氧化葡萄糖所必須的酶，從而破壞其細胞膜，將其殺死，多余的氧原子則會自行重新結合成為普通氧分子，不存在任何有害殘留物，故稱為無污染消毒劑。

 

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超凈工作臺/生物安全柜使用注意事項

 

*所有使用人員在開始實驗前，請用紫外線燈正確照射30min。工作臺面上的操作均要保證無菌。

 

● 開啟后，請用酒精棉球擦拭工作區域，或者噴灑酒精后用無塵紙擦拭，所有放入超凈臺或生物安全柜的物品均需要消毒擦拭。

● 準確設置操作臺面的不同區域，有序開展實驗操作。

● 操作結束，及時清理個人物品，清潔工作臺面，開啟紫外線燈消毒。

右手操作習慣的區域設置（圖源網絡，侵權必刪，僅供參考）

 

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顯微鏡使用注意事項

*常規顯微鏡使用前后可使用酒精棉球擦拭載物臺。載物臺如有污染物，需要仔細清潔后再使用。

● 使用完畢，請及時關閉燈光與電源。必要時請套上防塵罩。

（圖源網絡，侵權必刪，僅供參考）

 

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細胞培養箱使用注意事項

*細胞培養箱按照正確方法進行安裝、校準、使用、維護。定期清潔，保證培養箱正常運作，避免細胞污染。

 

● 培養箱需要定期使用消毒液擦拭內表面進行消毒，正常取放培養物均可以消毒雙手或門把手等。

● 培養箱的水盤定期滅菌，根據實際情況換水（高壓滅菌水或純水）。如出現培養箱污染，需要添加水盤清除劑（VivaCell，C3480-0100），必要時更換培養箱的濾芯等。

（圖源網絡，侵權必刪，僅供參考）

 

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水浴鍋使用注意事項

*所有放入水浴鍋的物品均要避免滲漏。如有滲漏需要及時換水，并做徹底消毒清潔，避免污染其他物品等。

 

● 水浴鍋使用注意用電安全。注意水位，避免空燒。

● 水浴鍋內如出現異物，請及時清潔換水，如出現污染，請使用水浴鍋清除劑。

（圖源網絡，侵權必刪，僅供參考）

 

8

離心機使用注意事項

*所有放入機器進行離心的樣本均要進行配平處理。嚴禁開蓋運轉操作。

● 請選擇合適的轉子，離心時請保證液體體積不能超過離心管總體積的2/3。

● 離心機內部如有冷凝水，請及時使用無塵紙擦拭。如遇液體樣本漏出，及時清潔干凈。

（圖源網絡，侵權必刪，僅供參考）

 

9

其他試劑耗材使用注意事項

 

*所有細胞實驗中使用到的試劑耗材均需要無菌處理。如有重復使用的耗材，請按照正確的清洗、滅菌等程序進行驗證測試。 

 

● 細胞培養相關試劑正確儲存。為保證使用質量，請在開封后盡快使用，避免質量下降或者污染。

● 耗材產品需要正確保存，避免包裝破損導致產品污染。已經開封外包裝的產品可保存于生物安全柜或超凈臺內。

 

*以上設備、試劑或耗材的使用注意事項，僅與無菌相關的事項，其它注意事項請參考各自實驗室信息。
 

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