辣椒作為一種常見的食品調味料，除直接食用或淺加工外，還可以提取辣椒素作為食品添加劑制作辣味食品。它還具有抗菌、鎮痛和助消化的特性，被廣泛應用在醫藥領域。
 

辣椒素的化學法合成都是以香草胺和8-甲基-6-壬烯酸作為反應底物利用Schotten−Baumann反應進行的。目前，其前體物質香草胺都是通過貴金屬催化石油化工產品而得到的。然而，這種方法并不符合綠色化工的要求。



石河子大學化學化工學院張根林教授團隊在ACS Sustainable Chemistry & Engineering上發表了最新的研究成果“Yeast-Based Whole-Cell Factory for the Ecofriendly Synthesis of Vanillylamine as a Critical Step toward Capsaicin Production”。該研究團隊在解析香草胺生物合成途徑基礎上，構建了以苯丙氨酸和酪氨酸為前體的香草胺酵母全合成體系。

 

研究人員利用酵母異源重組香草胺生物合成途徑得到香草胺的產率為6.47 g/L，然后通過上調莽草酸途徑來增強苯丙氨酸使香草胺的產量增了11%，進一步的通過重組的S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)循環優化甲基轉移效率，使香草胺產量提高了84%，最后將酵母菌株從Z2切換到Z6，并重新連接了前體和SAM循環，在1L平行生物反應器(迪必爾生物）上進行了測試，最終香草胺的產量提高到了14.89 g/L（125%），這是目前公開數據中的最高水平。

 

研究路線

 

一、釀酒酵母生產香草胺生物合成途徑的建立

 

為了構建香草胺生產菌株，研究人員設計了兩個模塊：咖啡酰輔酶A合成模塊和香草胺合成模塊（圖2）
 

圖2 香草胺和辣椒素在工程酵母中的生物合成途徑

 

模塊1涉及前體咖啡酰基輔酶A的合成，需要四種酶的催化，包括苯丙氨酸銨裂解酶(PAL)、肉桂酸4-羥基酰化酶(C4H)、肉桂酰連接酶(4CL)和羥基肉桂酰轉移酶(HCT)。

 

研究人員在含有500 mg/L苯乙醇、0.18mg/L CAPE和49.9 mg/L對香豆酸的YPD培養基中進行搖瓶發酵測試，通過HPLC - MS/MS檢測搖瓶發酵結果(圖3a)。出乎意料的是，在工程菌株Z1-1中檢測到2.94 mg/L阿魏酸(圖3a)。而阿魏酸理論上應該由下一步的CAMT產生，這一發現暗示在Z1-1菌株中可能發生了一些未知的反應。

 

模塊2涉及將咖啡酰輔酶A轉化為香草胺，并要求表達咖啡酰輔酶A-氧-甲基轉移酶(CAMT)、阿魏酰輔酶A水合酶/裂解酶(FerB)和推測的轉氨酶(pAMT)。模塊2轉化過程中需要CAMT、 FerB和pAMT這三種酶。研究人員通過優化得到了Z2菌株，接著在1L平行生物反應器中利用分批補料培養的方式培養96 h后，Z2菌株產生6.47 g/L的香草胺(圖4b)，因此在釀酒酵母中首次實現了香草胺的從頭生物合成。并在Z2菌株發酵培養液中檢測到肉桂酸(86.14 mg/L)和咖啡酸(2.36 mg/L)等中間產物(圖3a)，表明兩個模塊之間協同作用良好。
 

圖3 工程菌株在培養96 小時的中間產物分析

（a）96h時Z1-1和Z2菌株中間產物含量

（b）工程菌株補料批次發酵過程中OD₆₀₀與時間的關系

（c）96h時對工程菌株（Z2、Z3、Z4和Z5）中的酚酸進行定量分析

（d）96h時在所有測試菌株（Y1和Y2）的發酵液中檢測原兒茶酸。

（e）香草胺生產的推測途徑。

圖4 工程酵母合成香草胺

（a）采用高效液相色譜法對香草胺進行了定性分析。

（b）在96h時通過HPLC對香草胺的產生進行定量。

 

二、另一種香草胺的生物合成途徑的發現

 

研究人員發現在Z2菌株中中間產物較低，為了增加苯丙氨酸和酪氨酸的通量，將TAL、Aro9和PheA引入Z2菌株的δ1位點,構建了Z3菌株。

 

對Z3菌株進行了發酵測試，測試條件為在初始葡萄糖濃度為2%的YPD培養基中培養后，Z3菌株的香草胺產量為7.16 g/L，比Z2菌株增加了11%(圖4b)。但肉桂酸的積累明顯減少，Z3的肉桂酸積累量為18.91 mg/L，僅為Z2積累量的21%。

 

此外，還檢測到原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸三種新化合物，滴度分別為23.38mg/L、20.51mg/L和5.24 mg/L(圖3c)。

 

經過一系列的研究測試，發現了另一條香草胺的生物合成途徑，通過增加苯丙氨酸和酪氨酸的供應增加了香草胺的產量。

 

三、調節SAM生物合成來提高香草胺的生產

 

咖啡酰輔酶A轉化為阿魏酰輔酶A以及原兒茶酸轉化為香草酸都需要甲基化，其中SAM充當甲基供體。研究人員采用兩種策略通過重構SAM循環來提高甲基轉移效率。利用釀酒酵母的SAHase編碼基因（SahH）和擬南芥的MAT編碼基因（SAM2）共轉化到Z2或Z3菌株的rDNA整合位點分別構建了Z4或Z6菌株。此外，將大腸桿菌的Mtn和LuxS與SAM2共轉化到Z2或Z3菌株，分別產生了Z5或Z7菌株。

 

接著研究人員將得到的Z4、Z5、Z6和Z7菌株在1L平行生物反應器中進行了發酵測試，發酵條件為：溫度30°C，初始葡萄糖為20g/L，發酵24小時后每12小時進行一次補料操作，直到96小時發酵結束。在發酵過程中使用氫氧化鈉/硫酸控制pH保持在7.0。結果顯示，Z4和Z5菌株的香草胺滴度分別為9.21和11.88 g/L（圖4b），與工程Z2菌株相比，滴度分別提高了42%和84%。此外，在Z6和Z7菌株中分別檢測到14.89g/L和14.07g/L的香草胺，與Z2菌株相比增加了125%。

 

這些結果表明，這兩種策略都有效地改善了SAM作為甲基轉移反應的甲基供體的積累，從而促進了代謝途徑的平衡。

 

此外，他們也發現了與野生型酵母（CK）相比，所有工程菌株的生物量都有所減少（圖3b）。在發酵96小時后，Z4、Z5、Z6和Z7的生物量分別下降了25%、13%、10%和18%，積累的醋酸鹽分別達到了2.28g/L、3.03g/L、2.06g/L和2.95g/L。因此，可能的原因為香草胺和醋酸會抑制菌株的生長與活力。

 

四、在酵母細胞中通過香草胺的酯化實現了辣椒素的從頭合成。

 

在辣椒素合成酶(CS)的催化下，香草胺能與8-甲基-6-壬烯酰輔酶A酯化反應生成辣椒素。在此基礎上，研究人員設計了模塊3，并在初始Z2菌株上構建了C1菌株，在1L的平行反應器上做了相應的發酵測試，采用補料批次培養策略，發酵初始培養基葡萄糖濃度為20g/L,培養120h,辣椒素的產量為80.23μg/L（圖5）,因此實現了辣椒素在釀酒酵母細胞上的重頭合成。此外，在C1菌株中還檢測到142.46 g/L的8-甲基-6-壬烯酰輔酶A和6.02 g/L的香草胺。8-甲基-6-壬烯酰輔酶A供應過慢可能會限制辣椒素的生產。

 

因此，增加8-甲基-6-壬烯基酰輔酶A的積累將是酵母生產辣椒素的潛在有益途徑。
 

圖5 工程酵母合成辣椒素

(a) 采用HPLC - MS/MS對辣椒素標準品進行定性分析

(b) 采用HPLC - MS/MS對樣品進行定性分析

參考文獻 

Zhao, J. , Li, Y. , Yi, L. , Zhang, G. , & Ye, B. . (2023). Yeast-based whole-cell factory for the ecofriendly synthesis of vanillylamine as a critical step toward capsaicin production. ACS Sustainable Chemistry & Engineering.
 

平行生物反應器

研究使用的1L生物反應器屬于迪必爾生物的Minibox 系列平行生物反應器。
 

圖6 Minibox 5  第5代平行生物反應器

 

迪必爾平行生物反應器從最初的minibox 1到minibox 5（圖6），再到2021年推出的顛覆性產品——CloudReady™️云生物反應器（圖7），迪必爾一直致力于協助合成生物學領域科學家進行科研與創新。CloudReady™️云生物反應器整合了多種補料策略，同時產品軟件中內置實驗設計（DoE）與分析軟件可以幫助用戶快速的進行布局實驗，縮短產品的開發周期。
 

圖7  CloudReady ™️云生物反應器

 

D²MS軟件內置3D Visual DoE可視化實驗設計：

· 可交互三維圖形展示實驗設計,使實驗設計不再抽象，富有趣味性。

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