“道生一，一生二，二生三，三生萬(wàn)物”。這是出自老子《道德經(jīng)》第四十二章的一句話，它道盡了干細(xì)胞的玄妙。那什么是“生萬(wàn)物之道呢”？對(duì)于干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，要做到“生萬(wàn)物”，合適的誘導(dǎo)分化是關(guān)鍵。如21年德國(guó)杜賽爾多夫海因里希海涅大學(xué)的Jay Gopalakrishnan團(tuán)隊(duì)用醋酸視黃醇誘導(dǎo)的眼睛類器官[1]；維也納奧地利科學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)誘導(dǎo)的心臟類器官[2]。而在進(jìn)行誘導(dǎo)分化“轉(zhuǎn)化萬(wàn)物”之前，干細(xì)胞的“一生二，二生三”也是不可忽視的。如何在“轉(zhuǎn)化萬(wàn)物”前擴(kuò)增制備足夠數(shù)量的干細(xì)胞而又不使其經(jīng)受刺激“提前轉(zhuǎn)化”呢？那當(dāng)然就是選擇一款性能優(yōu)異、誘導(dǎo)干擾極低的基質(zhì)膠啦！

 

本周我們對(duì)Cat.No.082777/0827775基質(zhì)膠進(jìn)行了ES細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)評(píng)。讓我們一起看看怎么培養(yǎng)ES細(xì)胞以及最終效果吧！
 

一.樣本信息

模基基質(zhì)膠


對(duì)照組

 

二.實(shí)驗(yàn)流程

 

1.培養(yǎng)材料

試劑：ES細(xì)胞、MatrigengeL Matrix、10mM ROCK 抑制劑（Y-27632，工作濃度10μM）；DMEM /F12培養(yǎng)基；mTeSR1/E8培養(yǎng)基；Accutase/EDTA解離劑；PBS(D-PBS)；

材料：無(wú)菌槍頭；6 孔板；無(wú)菌EP管等耗材；可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)自行調(diào)整。

 

2.培養(yǎng)預(yù)備

（1）配置基質(zhì)膠混合液

a、將基質(zhì)膠置冰上在4℃冰箱過(guò)夜解凍；

b、4℃預(yù)冷無(wú)菌離心管、無(wú)菌槍頭、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基等接觸基質(zhì)膠的耗材或試劑；

c、將Matrigengel（Cat.No.0827775）按1:80 - 1:100的比例稀釋，對(duì)于ES細(xì)胞培養(yǎng)，建議涂布濃度約為0.013mg/cm²。

例如，將12.5mg/mL的Matrigengel使用冰冷的DMEM/F12，1:100稀釋后，每個(gè)6孔板的涂布量為1mL。
 

（2）制作基質(zhì)膠涂層

a、按照0.013mg/cm²的量加入Matrigengel混合物加入到預(yù)冷的6孔板中，并輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板以確保混合物均勻地分布在培養(yǎng)板上；

b、將6孔板轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行過(guò)夜孵育（孵育1-2小時(shí)后即可使用，但過(guò)夜孵育的涂層更有利于細(xì)胞培養(yǎng)）；

c、使用前吸棄涂層上面的液體。

 

3.ES傳代

（1）傳代前準(zhǔn)備好基質(zhì)膠涂布的六孔板及含10μM Y-27632抑制劑的培養(yǎng)基；

（2）顯微鏡下觀察ES細(xì)胞狀態(tài)，在潔凈工作臺(tái)中吸棄舊培養(yǎng)基，用半培養(yǎng)基量的PBS沖洗后加入培養(yǎng)量一半體積的Acuutase（6孔板中加入0.5mL即可）；

（3）轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱消化4分鐘，或在顯微鏡下觀察直到大部分細(xì)胞脫落；如果細(xì)胞仍然附著，輕輕拍打培養(yǎng)板3-5次，或者在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間（不超過(guò)15分鐘）；

（4）傾斜培養(yǎng)板，將Accutase溶液沿培養(yǎng)層表面轉(zhuǎn)移兩次，分離結(jié)塊并轉(zhuǎn)移到離心管中；

（5）用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)層表面，并與管中的細(xì)胞溶液合并在一塊；

（6）室溫下300g 離心5分鐘（殘留的Accutase會(huì)干擾細(xì)胞的附著和下游應(yīng)用，如果進(jìn)行轉(zhuǎn)染，應(yīng)該盡量去除干凈）；

（7）吸去上清，用含有10μM Y-27632抑制劑的培養(yǎng)基進(jìn)行重懸；如果需要，可以用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞鋪板的體積和面積；

（8）將細(xì)胞加入涂層板中，輕輕搖動(dòng)使細(xì)胞分布均勻；

（9）將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

4.結(jié)果觀察

（1）培養(yǎng)24h后換液，撤掉含抑制劑的培養(yǎng)基，換為正常培養(yǎng)基；

（2）換液后24h觀察并拍照記錄。

注意：MatrigengeL Matrix> 4℃時(shí)會(huì)逐漸聚合成膠，請(qǐng)嚴(yán)格把控操作溫度，控制操作時(shí)間，稀釋后的基質(zhì)膠混合液同樣需要冰上操作；板材可以在孵育一小時(shí)后使用，但過(guò)夜孵育的涂層可以使細(xì)胞產(chǎn)生較好的長(zhǎng)期形態(tài)。

 

三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

10×物鏡下視野

 

4×物鏡下視野

 

四.結(jié)果分析

 

1.從細(xì)胞的克隆形成率以及克隆面積上看，用Brand C基質(zhì)膠培養(yǎng)的ES細(xì)胞與用模基基質(zhì)膠培養(yǎng)的效果相當(dāng)。 

2.兩款基質(zhì)膠均無(wú)細(xì)胞分化現(xiàn)象產(chǎn)生。

 

五.關(guān)于模基基質(zhì)膠

 

模基生物基質(zhì)膠經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)檢驗(yàn)證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩(wěn)定性好、低內(nèi)毒素、無(wú)污染的特點(diǎn)。在購(gòu)買模基產(chǎn)品時(shí)，根據(jù)用戶個(gè)性化的需求對(duì)用戶進(jìn)行最佳產(chǎn)品、貨號(hào)的推薦，以便用戶獲得性價(jià)比最高、效果最優(yōu)的產(chǎn)品。

 

進(jìn)行ES細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)推薦使用干細(xì)胞專用金牌基質(zhì)膠，干細(xì)胞專用金牌基質(zhì)膠是在低生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠之上再次進(jìn)行優(yōu)化并附加多項(xiàng)測(cè)試的基質(zhì)膠，去除干擾因子，更適合干細(xì)胞的生長(zhǎng)以及后續(xù)添加因子和抑制劑的人為誘導(dǎo)分化。

 

六.參考資料

[1] https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.07.010

[2] https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.034