發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
發(fā)表時(shí)間：2019年
合作單位：第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院

今天百趣代謝組學(xué)將給大家分享Nature Communications上的一篇文章：ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield。

百趣代謝組學(xué)分享，氟尿嘧啶（Fu）是最常用的治療直腸癌（CRC）的藥物。然而因藥物抗性，極大限制了其治療的療效。自噬（macroautophagy）是一種細(xì)胞分解代謝過程，自噬有潛力為附近所有代謝途徑供能，為細(xì)胞提供巨大的代謝可塑性。代謝重編程和代謝酶的異常活躍被認(rèn)為是惡性腫瘤的特征之一。

作者證明ABHD5定位于溶酶體后與PDIA5相互作用，防止PDIA5與RNASET2相互作用，從而使RNASET2失活。代謝組學(xué)分享，它會(huì)損害RNASET2介導(dǎo)的自噬尿嘧啶產(chǎn)量，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞將FU作為外源尿嘧啶攝入，從而增加其對(duì)FU的敏感性。研究結(jié)果首次揭示了ABHD5在調(diào)節(jié)溶酶體功能中的新作用，對(duì)基于FU輔助化療后的機(jī)體恢復(fù)提供了重要見解。

ABHD5降低了CRC細(xì)胞對(duì)FU的敏感性

圖1 ABHD5降低了CRC細(xì)胞對(duì)FU的敏感性
 

采用癌癥藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)集，將ABHD5表達(dá)水平與化療結(jié)果相關(guān)的敏感性數(shù)據(jù)集集合起來(lái)，通過Pearson’s correlations的分析方法，ABHD5表達(dá)在pMMR和dMMR CRC細(xì)胞系中都和IC50呈現(xiàn)正相關(guān)（圖1a）。代謝組學(xué)分享，相比較與正常的癌細(xì)胞，ABHD5基因敲除的細(xì)胞（ABHD5 KD）在FU處理下IC50，細(xì)胞活力顯著降低（圖1b-c），細(xì)胞凋亡率顯著升高（圖1d）。

隨后作者做了小鼠實(shí)驗(yàn)，通過生物發(fā)光成像和TUNEL染色，得到同樣的結(jié)論，ABHD5 KD組小鼠對(duì)FU處理后腫瘤負(fù)荷明顯減小（圖e），并且組織中腫瘤細(xì)胞凋亡率增加（圖f）。代謝組學(xué)分享，對(duì)不同的小鼠做ABHD5基因敲入和敲除后，用PBS或FU處理，每隔一段時(shí)間給小鼠和腫瘤組織稱重，發(fā)現(xiàn)ABHD5 KD+FU處理組明顯病情得到緩解（圖1g-h）。再通過Caspase-3對(duì)凋亡細(xì)胞或Ki67對(duì)增殖細(xì)胞做免疫組化檢測(cè)，也得到相同的結(jié)論ABHM5 KD+FU處理明顯抑制了細(xì)胞的增值并表現(xiàn)較強(qiáng)的敏感性（圖1i-j）。

FU輔助的化療效果受ABHD5表達(dá)量影響

圖2 ABHD5的表達(dá)以及FU輔助化療的療效

將NCBI-GEO數(shù)據(jù)集中361名CRCs患者分為ABHD5 high組（262例）和ABHD5 low組（99例），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示ABHD5 high可能是BRAF陽(yáng)性突變（BRAF MT），p53野生型（p53 WT）和染色體不穩(wěn)定陰性型（CIN-）（圖2a-b）。只用FU治療的ABHD5 high效果較好，有化療的還是ABHD5 low組更好（圖2c-d）。代謝組學(xué)分享，用另外一組大數(shù)據(jù)量進(jìn)行驗(yàn)證，也是同樣的結(jié)果，ABHD5 low組更適合FU+化療（圖e-f）。

ABHD5通過提高自噬性
尿嘧啶的產(chǎn)量來(lái)控制FU的攝取

圖3 ABHD5影響CRC細(xì)胞對(duì)FU的攝取
 

通過HPLC發(fā)現(xiàn)ABHD5 KD細(xì)胞中FU濃度增加，WB顯示PBS或者FU處理的正常癌癥細(xì)胞中都沒有發(fā)現(xiàn)TS, TP,DPD（這3個(gè)酶控制FU代謝）的變化，可能是FU濃度和藥物吸收能力相關(guān)（圖3a-b）。代謝組學(xué)分享，但是FU處理后，ABHD5 KD細(xì)胞尿嘧啶減少（圖3c），但是尿嘧啶生物合成限速酶CPS II和UMPS沒有發(fā)生變化（圖3d）。ABHD5可能通過其他的方式影響了尿嘧啶的產(chǎn)量。

在GSE38832數(shù)據(jù)集122例CRCs，ABHD5 low組溶酶體途徑相關(guān)基因是下降的（圖3e），根據(jù)數(shù)據(jù)做了個(gè)熱圖，猜想溶酶體RNA的降解使得細(xì)胞產(chǎn)生了自噬，從而提高了尿嘧啶的含量（圖3f）。HCS分析顯示自噬體的量和FU的含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（圖3g-h）。代謝組學(xué)分享，ABHD5過表達(dá)的細(xì)胞在FU和靶向藥物處理后，才使得胞內(nèi)尿嘧啶和FU的濃度提高（圖3i-j）。在PDX模型中BECN1激活劑對(duì)ABHD5 KD中的尿嘧啶和FU的濃度影響不是很大（圖3k-l）,說明ABHD5通過其他途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。

LC-MS檢測(cè)ABHD5通過

RNASET2來(lái)促進(jìn)細(xì)胞自噬

圖4 RNASET2調(diào)控ABHD誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
 

采用LC-MS檢測(cè)FU作用下尿嘧啶和相關(guān)的核苷含量的變化，ABHD5 KD組中核苷和尿嘧啶的含量沒有什么變化，可能是RNASET2催化RNA分解過程并參與ABHD誘導(dǎo)細(xì)胞自噬（圖4a-c）。代謝組學(xué)分享，ABHD5 KD和RNASET2 KD組中核苷產(chǎn)生后一會(huì)就沒有了，ABHD5高表達(dá)+RNASET2 KD組中反而對(duì)FU敏感了（圖4d-g）。這些結(jié)果表明，ABHD5通過RNASET2來(lái)促進(jìn)細(xì)胞自噬，使得尿嘧啶含量增高。

ABHD5保護(hù)RNASET2不被PDIA5滅活

圖5 ABHD5維持RNASET2的活性
 

通過免疫熒光染色和WB檢測(cè)說明ABHD5定位于溶酶體并調(diào)節(jié)RNASET2的活性（圖5a-b）。代謝組學(xué)分享，酵母雙雜實(shí)驗(yàn)表明ABHD5不直接和RNASET2直接作用，而且ABHD5 KD的細(xì)胞中RNASET2表達(dá)量沒有變化（圖5c-e）。通過蛋白芯片檢測(cè)，表明ABHD5與RNASET2是共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PDIA5的關(guān)系，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬，減弱CRC細(xì)胞對(duì)FU的敏感性（圖5c-m）。

結(jié)論

圖6 文章機(jī)制示意圖
 

ABHD5定位于溶酶體，并且和RNASET2共享PDIA5中的相同相互作用域。 ABHD5直接與PDIA5相互作用，以防止PDIA5直接與RNASET2相互作用并使RNASET2失活。ABHD5缺乏釋放使得PDIA5直接與RNASET2相互作用，使RNASET2處于失活狀態(tài)，這會(huì)損害RNASET2誘導(dǎo)的自噬尿嘧啶產(chǎn)量。 ABHD5缺乏促進(jìn)CRC細(xì)胞攝取FU作為外源性尿嘧啶，從而增加其對(duì)FU的敏感性。 代謝組學(xué)分享，相反，由于自噬尿嘧啶產(chǎn)量增加，ABHD5使得的CRC細(xì)胞顯示出對(duì)FU的抗性。

LC-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測(cè)
BIOTREE LC-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測(cè)通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）方法檢測(cè)生物體受外界刺激前后體內(nèi)大多數(shù)小分子代謝物的動(dòng)態(tài)變化，重點(diǎn)尋找在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中有顯著變化的代謝物，進(jìn)而研究這些代謝物與生理病理變化的相關(guān)關(guān)系，其研究對(duì)象大都是分子量1500Da以內(nèi)的小分子物質(zhì)。