本文要點：腎臟纖維化在世界范圍內普遍存在，因此早期診斷具有重要意義。近紅外窗口光學成像已被公認為一種及時發現腎功能障礙的有吸引力的技術。然而，研制一種能夠早期監測腎臟纖維化并同時可清除正常人群腎臟中的造影劑仍然具有挑戰性。本文精心設計了一種具有聚集誘導發射(AIE)特征的納米熒光團，即AIE- 4PEG550 NPs。適用于通過短波紅外(SWIR, 900-1700 nm)熒光和光聲雙峰成像對纖維化的早期進展縱向可視化。AIE-4PEG550 NPs體積小(約26 nm)，腎臟可過濾分子量為3.3 kDa，腎臟清除率高(24 h內通過腎臟排出93.1±1.7%)，出色的成像性能和良好的生物相容性，這些特點使AIE-4PEG550 NPs遠遠優于臨床診斷測定。本研究的發現將為下一代診斷腎纖維化程度的試劑提供了藍圖。
 

背景：慢性腎臟疾病(CKD)的流行極大地影響了全世界人民的健康。鑒于CKD發病率高、潛伏期大的特點，為防止情況惡化為嚴重的腎功能障礙，早期識別纖維化腎臟組織是必要的。截至目前，評估腎臟纖維化可通過腎臟活檢、計算機斷層掃描CT、正電子發射斷層掃描PET、磁共振成像MRI等，但這些方法可能面臨高出血風險、設備的不可及性，高輻射風險和含重金屬造影劑誘發的潛在腎毒性。因此，本文提出的AIE- 4PEG550 NPs以一種非侵入性的成像方式，高靈敏度的光學成像、優越的空間和時間分辨率、多功能和各種成像劑的可及性對早期的腎臟纖維化進行實時診斷。

研究內容：分子設計和光物理性質研究：首先通過簡單的步驟得到目標熒光團AIE-4COOH，關鍵步驟有 4，4'-（苯基氮雜二酰基）二苯甲醛與化合物1之間的Wittig反應，4,7-二溴5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(DPTQ)與中間體5之間的Suzuki偶聯反應。為了使生成的AIE-4COOH具有良好的水溶性，將羧基與0.55 kDa PEG-NH2進一步聚乙二醇化，通過簡單的縮合反應得到AIE-4PEG550。優化的AIE-4COOH分子幾何結構表明，DPTQ核與相鄰苯環之間的二面角均為45°，表明分子幾何結構充塞，有助于抑制π-π的堆積。除了三苯胺單元中的三個立體擁擠苯環外，DPTQ核中還有兩個可自由旋轉的苯環，喹喔啉核與相鄰苯環之間二面角為39°(Figure.1A)。如Figure1B所示，最低未占據分子軌道的電子密度(LUMO，-3.05eV) 主要集中在缺電子的DPTQ核上，而最高占據分子軌道(HOMO， -4.87 eV)沿共軛骨架分布，表明分子內電荷轉移特性突出。AIE-4COOH的最大吸收峰在~ 630 nm處，發射峰在910 nm處(Figure.1C)。隨后使用不同水比例的DMSO/水體系對AIE特征進行了探索。如Figure1D所示，當水比逐漸增加到70%時，AIE-4COOH的亮度增強。AIE4PEG550在水中溶解良好，在645 nm處有一個吸收峰，摩爾吸收系數(ε)為5.8 × 104 M-1cm-1，在SWIR區有一個最大發射峰，尾延伸到第二近紅外窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)(Figure.1E)。同時，AIE- 4peg550在DMSO/水混合物中也表現出良好的AIE特征，動態光散射(DLS)分析顯示，AIE-4PEG550 NPs的流體動力學直徑為26 nm，適合于腎臟清除(Figure.1F)。如Figure1G所示，AIE-4PEG550 NPs的熒光強度隨著濃度的增加而增加，在60 μM濃度下仍能保持較高的發射強度，這有利于染料在靶位點的積累。相反，市售吲哚菁綠(ICG)在濃度低于5 μM時發射量逐漸增加，高濃度時發射量急劇下降。此外，AIE-4PEG550 NPs表現出可接受的光穩定性，因為在連續660 nm光照30分鐘后，監測到的發射強度只有輕微下降。相反，經過相同處理后，ICG完全光漂白(Figure.1H)。
 

Figure 1

人類腎臟細胞的熒光成像: 隨后采用標準的CCK-8實驗評估了AIE-4PEG550 NPs對體外HK-2細胞的細胞毒性。如Figure.2A所示，NPs表現出良好的生物相容性，在0 ~ 100 μ g mL-1的材料存在下，存活率超過95%。培養24小時后，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)和SWIR顯微鏡成像觀察AIE-4PEG550 NPs的細胞攝取，并用核特異性藍色熒光染料聯合染色驗證(Figure.2B)。如Figure.2C所示，60次循環掃描后，保留了80%的初始熒光強度，成像穩定性良好。

Figure2

活體腎纖維化的光學成像: 我們將AIE-4PEG550 NPs靜脈給藥給正常C57BL/6小鼠(簡稱“正常”組)。如Figure.3A所示，AIE-4PEG550 NPs處理4 min后，使用900 nm長通濾波器，通過FLI在SWIR區域可見雙側腎臟的輪廓。值得注意的是，由于腎臟排泄效率極好，肝臟幾乎沒有信號。腎臟信號在注射后4min迅速上升至峰值，40min后逐漸消失。多次證實PAI結合了優越的空間分辨率和深度穿透深度的優點。如Figure.3B所示，在腎臟部位可見到較強的PA信號，與FLI所得結果一致。同時，膀胱內AIE-4PEG550 NPs產生的熒光信號和PA振幅隨著時間的推移不斷增加，在給藥后60 min達到最大值。然后，這些物質可以通過尿液從膀胱中徹底排出，避免潛在的毒性(Figure.3CD)。定量分析表明，注射后4 min和60 min，腎臟區域FLI/PAI強度分別比未注射的小鼠高1.63/4.8倍和1.08/1.04倍。膀胱的相應數據分別為1.89/4.78倍和4.69/16.4倍，說明AIE-4PEG550 NPs從腎臟向膀胱的排泄速度較快(Figure.3EF)。
 

Figure3

在確認其對正常腎臟小鼠的超快腎臟排泄能力后，作者進一步利用AIE-4PEG550研究其在葉酸誘導的腎病模型中的行為，這是一個完善的模型，發展為腎小管間質纖維化。與腎功能正常組形成鮮明對比，180min內熒光強度持續增強，表明AIE-4PEG550在腎臟內蓄積(Figure.4AB)。由于腎臟功能障礙，通過尿液排泄的代謝減慢，在180分鐘內，膀胱內的FL/PA強度明顯減弱，并以溫和的速度增長 (Figure.4DE)。直觀量化的變化表明，在20、60和180分鐘后FLI/PAI信號在指定腎臟區域分別比預處理小鼠增加2.26/1.5、2.78/5.5和4.06/10.0倍(Figure.4G)。平行比較三組腎臟的FL強度。如Figure.4H所示，“1周”組的FL強度在180 min內持續上升至4.07倍，與其他兩組形成了鮮明的對比。具體來說，正常組的FL信號與注射后40 min的背景信號相似。而“4周”組，給藥后FL信號維持在1.6倍左右。此外，腎臟-膀胱(Rktb)的FL強度比被評估為時間的函數，從中我們可以清楚地識別腎臟纖維化:Rktb > 1表示腎臟早期纖維化(Figure.4I)。

Figure4

與其他檢測方法比較：對腎組織進行H&E、Masson三色染色等組織學分析，定量評估間質纖維化面積，成功建立不同程度腎纖維化小鼠模型(Figure.5AB)。臨床評估腎功能障礙的診斷方法主要依賴血清肌酐(sCr)、血尿素氮(BUN)和腎小球濾過率(GFR)的監測。從Figure5CE中可以看到，盡管“1周”組的sCr和BUN明顯比“正常”組增加了2.82倍和1.67倍，但“1周”組的GFRs僅下降了17.4%。值得注意的是，本文開發的診斷方案可以在早期清晰地區分進行性腎纖維化。主要器官的H&E染色顯示，AIE-4PEG550 NPs沒有誘導各種組織破壞，說明其具有良好的生物安全性(Figure.5F)。

Figure5

總結：本文合成了一種水溶性NIR發射熒光團，即AIE-4PEG550，該熒光團在正常小鼠體內表現出良好的光穩定性和生物相容性，并具有極高的腎臟排泄效率(注射24 h后為93.1±1.7%)。此外，AIE-4PEG550 NPs同時開啟SWIR/NIR-II區FL信號和NIR-I區PA信號，可用于無創腎纖維化的實時雙模成像和鑒別。在正常和不同程度的腎纖維化小鼠體內注射AIE-4PEG550 NPs后，可通過腎臟和膀胱部位PL/PA信號強度的明顯變化實現縱向纖維化分期。與sCr、BUN和GFR等早期診斷腎功能障礙的臨床診斷方法相比，AIE-4PEG550 NPs在無創治療、腎臟清除效率高、生物相容性好等方面表現出明顯的優勢，因此在臨床前腎纖維化檢測中具有很大的前景。

參考文獻

DOI: 10.1002/adma.202206643

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