如何實現(xiàn)快速、穩(wěn)定的多色活細胞成像
MICA如何幫助用戶研究活細胞和動物
研究人員在活細胞成像技術(shù)的幫助下，可以深入了解活細胞甚至完整生物體的動態(tài)過程，這包括細胞內(nèi)和細胞外活動。一些代表性的示例包括蛋白質(zhì)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、免疫細胞遷移，類器官的細胞組織等。活細胞成像要求樣本和顯微鏡系統(tǒng)具備特定的屬性。在這篇文章中，我們描述了MICA對這些先決條件的具體調(diào)整，并提供了合適的示例。
活細胞成像
活細胞成像在微觀層面揭示了生物過程的信息。它要求將標(biāo)本保存在接近生理的條件下。下一段介紹了部分條件。典型的樣本包括細胞培養(yǎng)物、活組織、類器官或模式生物，通常使用熒光顯微鏡研究這類樣本。為此需要轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生表達熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因體。此外，還可以使用活細胞染料。
挑戰(zhàn)
環(huán)境條件：
為盡可能獲得接近真實狀態(tài)的實驗結(jié)果，活細胞成像條件必須模擬生理環(huán)境。不同的生物體所需的生理條件也不同，包括溫度、pH、氧氣含量等。例如，哺乳動物細胞要求的溫度是37°C左右，昆蟲細胞的最佳溫度是27°C，魚為28°C，而裂殖酵母則為30°C左右。
在碳酸氫鈉緩沖液的幫助下，細胞培養(yǎng)基內(nèi)的pH值持續(xù)保持在7.0-7.4，這就要求培養(yǎng)箱環(huán)境中相應(yīng)地存在二氧化碳。此外，培養(yǎng)箱的環(huán)境應(yīng)該是水飽和的，這樣就不會有培養(yǎng)基蒸發(fā)了。
體內(nèi)不同組織和細胞類型的氧含量不同。有趣的是，目前細胞培養(yǎng)箱和活細胞成像并沒有廣泛考慮氧的問題。不理想的氧氣水平會導(dǎo)致增殖率下降（高氧）或代謝率降低（低氧）（Hadanny, A.; Efrati, S.）。
光保護是活細胞成像的另一個挑戰(zhàn)，因為光照射可以影響活細胞本身以及熒光團。例如，強光可以導(dǎo)致DNA損傷或光漂白熒光團。
MICA的設(shè)計旨在應(yīng)對所有這些挑戰(zhàn)：
外殼本身就像一個培養(yǎng)箱。這意味著樣本周圍空間被加熱到所需的溫度（比室溫高5°C，最高42°C），并平衡到所需的二氧化碳濃度和濕度。
如果需要的話，氧氣濃度可以在一個額外的載物臺頂部腔室中控制。所有的參數(shù)均可通過MICA LAS X軟件控制。樣本的曝光由OneTouch功能設(shè)置，并可通過“樣本保護-圖像質(zhì)量”滑塊進行調(diào)整，以平衡所需的信號量與保護活細胞和熒光團。
為了在最小的環(huán)境干擾下獲取樣本，在前門中隱藏有一個小的服務(wù)擋板。
光可能是有毒的
由于光是帶入樣本的能量，它可能有負面的影響。任何光都可能干擾細胞內(nèi)的分子，例如紫外線可能傷害皮膚。此外，熒光團可能形成與分子相互作用的自由基。光的負面作用被稱為光毒性。挑戰(zhàn)在于能產(chǎn)生足夠的信號來解答科學(xué)問題的足夠光量與盡量減少光毒性的平衡。MICA通過提供一個工具來幫助用戶在不需要了解技術(shù)背景的情況下精確地平衡這兩件事——保護-質(zhì)量滑塊。只需點擊一下，OneTouch將根據(jù)滑塊上的選擇設(shè)置所有的激發(fā)和檢測參數(shù)。
細胞內(nèi)的動態(tài)變化可能非常快。例如，攜帶細胞器或囊泡的分子速度可達幾微米/秒（Alberts B.等人）。這影響了對圖像采集的要求，特別是當(dāng)需要對多個熒光團進行成像時。這里的問題是，生物不會暫停所有的熒光通道從而在相同的狀態(tài)下進行采集，而是持續(xù)不斷進行。在一個經(jīng)典的基于熒光過濾器的系統(tǒng)中，通常最耗時的步驟是為不同的通道更換濾光片。這導(dǎo)致實驗中兩個熒光團在兩個不同的時間點被監(jiān)測，導(dǎo)致無法實現(xiàn)精確的時空相關(guān)性。
MICA FluoSync™技術(shù)使用戶能夠同時獲得多達四個熒光通道。這意味著不同的囊泡、細胞骨架和運動蛋白可以以100%的時空相關(guān)性進行成像。此外，同步采集使成像時間點的節(jié)奏更快，因此，可以用更靈敏地記錄快速的細胞運動。
在給定的時間范圍內(nèi)記錄許多重復(fù)的情況
在一個實驗中記錄許多次重復(fù)可能是一個挑戰(zhàn)。假設(shè)用戶想每10分鐘記錄一次，那么在下一個周期開始之前，只能記錄一定數(shù)量的位置。通常情況下，如果您想在同一位置記錄多個標(biāo)簽，就會有更多限制，但MICA不存在這個問題。FluoSync™技術(shù)使用戶能夠以四倍的速度記錄，因為它最多可以同時獲取四個標(biāo)簽，從而為用戶留下更多的時間來記錄更多位置。用戶不必再在標(biāo)簽數(shù)量和位置之間進行權(quán)衡。
尋找正確的位置進行成像
在樣本的正確位置上尋找和設(shè)置實驗是具有挑戰(zhàn)性的。實驗人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數(shù)字顯微鏡可以生成樣本的預(yù)覽，這可以提供一些幫助，但實驗人員仍然需要指出圖像中要進一步成像的位置。MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低放大倍數(shù)或高放大倍數(shù)的預(yù)覽，輕松定位感興趣的區(qū)域，這些感興趣區(qū)域可以用工具直接在圖像上標(biāo)記出。通過這種方式，后續(xù)高分辨率的圖像可以保存下來。
選擇正確的活細胞成像物鏡
由于活細胞成像通常是在水溶液中進行的，高倍率物鏡使用水作為浸沒介質(zhì)，因為它與培養(yǎng)基介質(zhì)的光學(xué)特性相匹配。將水放在物鏡和樣品之間是很麻煩的，而且會導(dǎo)致樣本的焦點和位置的改變。此外，水蒸發(fā)得相當(dāng)快，因此需要不斷補充。MICA集反饋回路于一體，在水浸式物鏡的整個使用過程中，首先建立并維持浸沒狀態(tài)。這種方法不需要手動操作，可以進行長期實驗。
為進一步提高光學(xué)質(zhì)量，一些物鏡會通過校正環(huán)來補償樣本平板的厚度。校正環(huán)可手動、也可自動操作。MICA配置了自動校正環(huán)功能，可實現(xiàn)自動優(yōu)化。
重復(fù)實驗之間的可比性
科學(xué)實驗的一個關(guān)鍵方面是，盡可能少的變更可變參數(shù)以實現(xiàn)對樣品和結(jié)果影響的把控。這包括在所有的實驗中應(yīng)用同一套成像條件。一個方面是穩(wěn)定的環(huán)境條件（溫度、pH值和O2，也見上文）。另一個重要方面是相同的成像參數(shù)（激發(fā)和檢測）。MICA默認在不同項目中保持成像參數(shù)不變，用戶僅基于自己的需求進行調(diào)整。可根據(jù)參考圖像恢復(fù)成像參數(shù)。在環(huán)境條件方面，MICA是一個培養(yǎng)箱。MICA條件穩(wěn)定能允許MDCK囊腫連續(xù)生長3周（也見下文）。
方法
Mica有用于活細胞成像的特殊的樣本架。這包括用于小型（36毫米）和中型（60毫米）培養(yǎng)皿的支架。
囊泡:
U2OS細胞同時用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555進行染色。這兩種染料都聚集在細胞的質(zhì)膜和所有囊泡和內(nèi)體上。熒光劑同時或序列成像以進行比較。環(huán)境被設(shè)定為37℃恒溫和5%CO2，即生理pH水平。
對于高倍率成像，使用了帶有自動加水功能的63x/1.20水鏡。不需要人工操作。
斑馬魚:
圖像中的魚（斑馬魚）是一個帶有中胚層命運報告基因的轉(zhuǎn)基因魚（Tbxta：GFP）。在這個實驗中，一個發(fā)育中的胚胎從球期到體期被成像。用Dextran-Alexa647標(biāo)記間質(zhì)。胚胎保持在28℃。
囊腫：
a)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了EB1-GFP的MDCK細胞在基質(zhì)Matrigel中培養(yǎng)，在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上誘導(dǎo)囊腫生長。環(huán)境被設(shè)定為保持恒定的37℃，5%的二氧化碳和高濕度。
在第2天，細胞已經(jīng)顯示出三維聚團，并在基質(zhì)Matrigel內(nèi)高度流動。
在第9天，囊腫保持相對穩(wěn)定的位置，用較高的放大率（63倍）進行成像并在穩(wěn)定狀態(tài)下和隨著時間的推移（6天和6小時的時間間隔的GFP和IMC（明場成像的調(diào)制對比））。三維采集能獲得囊腫的三維圖像（418層，220.7納米間距，總Z-Stack大小92.02微米）。在第9天，一些囊腫除了EB1-GFP之外，還被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555標(biāo)記。
b)5000個穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了EB1-GFP的MDCK細胞在U型孔板中生長。有趣的是，這些細胞在幾天后也形成了囊狀結(jié)構(gòu)。其中一個囊狀結(jié)構(gòu)在共聚焦模式下被進一步研究，以進行三維重建。
結(jié)果
短期的快速事件實驗
U2OS細胞用兩種不同的熒光染料標(biāo)記相同的結(jié)構(gòu)，WGA-Alexa488和WGA-Alexa555，它們都與細胞膜結(jié)合。通過在MICA序列模式下獲取兩個通道的這個實驗設(shè)置能夠在獲取WGA-Alexa488（綠色）和WGA-Alexa555（紅色）之間引入一個人為的時間差。有了這種實驗設(shè)置，兩種不同的Alexa染料標(biāo)記同樣的膜結(jié)構(gòu)，能夠在最小時間差的兩個時間點成像。你可以在兩種方法的比較中看到，在同步掃描中所有的囊泡都是黃色的——即綠色和紅色的混合物，而在序列掃描中一些快速移動的囊泡看起來是兩種不同的結(jié)構(gòu)——即一個綠色和一個紅色的囊泡。
視頻 1：用WGA-Alexa488（綠色）、WGA-Alexa555（紅色）標(biāo)記的U2OS細胞。熒光通道是按序列成像的。你可以看到時空錯配，這可以通過來自同一結(jié)構(gòu)的綠色和紅色信號來識別。比例尺 = 5 µm。
視頻 2：用WGA-Alexa488（綠色）、WGA-Alexa555（紅色）標(biāo)記的U2OS細胞。熒光通道是同時成像的。比例尺 = 5 µm。
中期實驗
斑馬魚是一種模式生物，經(jīng)常用于發(fā)育研究。在這個例子中，我們感興趣的是研究細胞在空間的協(xié)調(diào)性，而這種協(xié)調(diào)性受到周圍組織的粘度的影響。在THUNDER模式下對兩個通道進行了24小時的成像，并使用大容量成像解析（LVCC）以獲得更多的細節(jié)。
視頻 3：表達中胚層命運報告基因的發(fā)育中的斑馬魚胚胎（Tbxta:GFP；綠色）。間質(zhì)液用Dextran-Alexa647（紅色）標(biāo)記。在超過24小時的延時拍攝中，用10x/0.32物鏡采集了25個z-層和250微米厚度的z-堆棧，時間間隔為15分鐘。使用了THUNDER 大容量成像解析（LVCC）。由Camilla Autorino提供，Petridou Group, EMBL Heidelberg（德國）。
長期實驗
MDCK細胞是極化的上皮細胞，如果在Matrigel這樣的基質(zhì)上培養(yǎng)，會成熟為所謂的囊腫。這些三維結(jié)構(gòu)可用于研究發(fā)育過程和潛在的蛋白質(zhì)運輸機制。這里，細胞被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了與GFP相連的微管結(jié)合蛋白，并在MICA中培養(yǎng)了3周。
圖3：MDCK囊腫。3周的活細胞實驗的提取物。時間間隔為6小時。擴展景深（EDOF）。上圖：通道疊加。中圖：EB1-GFP。下圖：寬場。THUNDER大容量成像解析（LVCC）。比例尺為20μm。圖片由德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。
發(fā)育9天后，用活細胞染料對上述一些囊腫進行了染色，以觀察肌動蛋白、微管蛋白和線粒體，此外還有GFP標(biāo)記的微管結(jié)合蛋白。隨后，在共聚焦模式下對囊腫進行了成像。
在U型孔板中培養(yǎng)細胞也可形成囊狀結(jié)構(gòu)。本實驗中，MDCK細胞從第1天開始在MICA上培養(yǎng)并在明場和寬場熒光模式下記錄，以研究囊腫的形成。MICA培養(yǎng)箱的特性使細胞在發(fā)展成囊狀結(jié)構(gòu)的過程中保持良好的狀態(tài)。
視頻 4：用10x/0.32物鏡、在GFP和明場通道下每隔30分鐘對囊腫形成進行了三天的成像。比例尺 = 200 µm。
培養(yǎng)14天后，在低倍鏡共聚焦模式對囊腫進行成像，以確定一個感興趣的囊腫。96孔板的情況下篩選樣本以尋找合適位置來做進一步研究可能是很麻煩的。Navigator工具在此幫助保持樣本的預(yù)覽，并輕松地導(dǎo)航到相關(guān)的感興趣的區(qū)域。
然后用63x物鏡在LIGHTNING共聚焦模式下對其中一個囊腫進行了更細節(jié)的成像。63x/1.20水鏡的加水是自動建立，并通過自動校正環(huán)對樣品進行了優(yōu)化。視頻5顯示了在共聚焦模式下獲得的卷積和用LIGHTNING處理的卷積的對比。
視頻 5：用63x/1.20水鏡在共聚焦模式下（左）用LIGHTNING（右）拍攝的單個第14天的囊腫（CLSM）。采集了285個Z-層， 57µm厚度的Z-層，并進行了三維重構(gòu)。
結(jié)論
MICA高度適用于快速、短期到幾周的長期活細胞成像實驗，幫助用戶獲得可靠的結(jié)果。集成的培養(yǎng)系統(tǒng)在溫度和pH值方面提供了接近生理的條件，使活細胞成像可以持續(xù)數(shù)周。另外，可以控制氧氣水平，以獲得更高的重要數(shù)據(jù)。FluoSync™技術(shù)可以同時對多達四個熒光團進行成像，這意味著可以對快速發(fā)生的細胞事件進行絕對的時空相關(guān)性成像。此外，F(xiàn)luoSync™縮短了記錄多色圖像之間的間隔，從而提高了時間分辨率。THUNDER和LIGHTNING幫助用戶從樣本中提取更多的細節(jié)，借助OneTouch的照明和自動浸水的自動化流程，即使是僅接受少量培訓(xùn)和有限技術(shù)背景的人員都可以輕松使用。
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參考資料
- Making Long-term Time-lapse Microscopy More Efficient, Science Lab (2022) Leica Microsystems.
- Hadanny, A.; Efrati, S. The Hyperoxic-Hypoxic Paradox. Biomolecules 2020, 10, 958.
- Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Molecular Motors.
發(fā)布者：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司
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