磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯 (TDCIPP)是一種典型的有機磷污染物，在水環境中廣泛存在。先前研究表明，TDCIPP通過蛋白磷酸化來發揮多重毒性，但是其中機理尚不明確。

2022年7月15日，國際頂尖環境科學期刊Journal of Hazardous Materials（IF 14.224）在線發表了中科院煙臺海岸帶研究所吉成龍等老師的創新研究成果“Toxicological effects of tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate in oyster Crassostrea gigas using proteomic and phosphoproteomic analyses”。該研究采用蛋白質組學和磷酸化修飾組學，結合傳統方法對不同濃度TDCIPP處理的牡蠣進行毒理效應研究。組學分析顯示，TDCIPP通過直接磷酸化關鍵蛋白或上游信號通路來調節轉錄、能量代謝、細胞凋亡和增殖，讓我們對TDCIPP的毒理機制有了新的認識。中科新生命提供了蛋白質組和磷酸化修飾組檢測服務。
 

研究材料

牡蠣
 

技術路線

步驟1：TDCIPP生物濃度；

步驟2：消化腺組織學變化；

步驟3：關鍵酶活性檢測；

步驟4：蛋白質組學分析；

步驟5：磷酸化修飾組學分析。

研究結果

1. TDCIPP生物濃度

與對照組相比，5和50 μg/L TDCIPP處理組牡蠣中TDCIPP含量顯著積累 (圖1)。

圖1 不同處理組牡蠣的TDCIPP積累

2. 消化腺組織學變化

H&E染色顯示對照組消化管腔呈十字形，消化細胞高，管腔窄，消化管上皮厚。TDCIPP處理組的上皮細胞較薄，管腔較寬，消化管管腔由十字形變為圓形，最高濃度(50 μg/L)處理組的消化細胞發生脫落（圖2）。
 

圖2 牡蠣消化腺的石蠟切片

隨著TDCIPP劑量的增加，消化管MLR/MET比值增加，其中50 μg/L TDCIPP處理組的牡蠣樣品MLR/MET值最高；5 μg/L TDCIPP處理組次之(圖3)。

圖3 不同處理組消化腺MLR/MET值

3.  關鍵酶活性檢測

CAT和GST活性在對照組和TDCIPP暴露組間無顯著差異。AChE的活性呈底部變化。在caspase-9活性方面，只有50 μg/L TDCIPP處理組顯著高于對照組。與對照組相比，TDCIPP治療組caspase-3活性無顯著變化（圖4）。

圖4 TDCIPP暴露后消化腺的酶活性

4. 蛋白質組學分析

從牡蠣消化腺樣本中共鑒定出6705個蛋白質。與對照組相比，50 μg/L TDCIPP處理組的牡蠣共有551個差異表達的蛋白質（DEPs），其中上調蛋白259個，下調蛋白292個。GO富集分析發現（圖5A），大多數DEPs位于細胞內(74)，參與代謝過程(147)和細胞過程(114)，分子功能主要集中在催化活性(168)和結合活性(131)。KEGG通路分析顯示（圖5B），上調的注釋蛋白在脂類和氨基酸的代謝過程中富集，下調的注釋蛋白在三個Hippo信號通路等中富集。其中，谷胱甘肽代謝通路覆蓋最多DEPs(8)；最顯著富集通路是維生素B6代謝；其他富集的KEGG通路與代謝過程有關。

圖5 50μg/L TDCIPP處理的消化腺中DEPs的GO富集柱狀圖(A)和KEGG通路富集氣泡圖(B)

5. 磷酸化修飾組學分析

在牡蠣消化腺中，共鑒定出850個磷酸化蛋白，152個蛋白被差異磷酸化。GO分析顯示（圖6A），在生物過程中，富集程度最高的是含蛋白復合體和細胞含蛋白復合體。大多數DPPs的分子功能是核酸結合(21)。細胞成分大多位于蛋白質-DNA復合體(3)、DNA包裝復合體(3)和核小體(3)中。KEGG通路分析顯示（圖6B），在MAPK信號通路、病灶黏附和TCA循環中，磷酸化蛋白高度富集。在50 μg/L TDCIPP處理組中，病灶粘連通路覆蓋的DPPs最多(5)。最顯著富集通路的是丙酮酸代謝。其他的富集通路參與信號轉導通路和能量代謝通路。將鑒定的DEPs與DPPs進行比較，發現在兩者間并未出現重疊蛋白，但KEGG分析表明，在TDCIPP處理后，DEPs和DPPs都參與了信號通路。

圖6 50 μg/L TDCIPP處理的消化腺中DPPs的GO富集柱狀圖(A)和KEGG通路富集氣泡圖(B)

小編小結

本研究利用蛋白質組學+磷酸化修飾組學，結合生化數據和組織學結果，發現TDCIPP具有刺激性神經毒素，會破壞細胞凋亡與細胞增殖之間的內部穩態。高濃度的TDCIPP可通過直接磷酸化關鍵蛋白或其上游信號通路導致轉錄、能量代謝、細胞凋亡和增殖等過程發生異常。