根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IACR）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據，僅2020年中國新發癌癥病例就高達457萬例，死亡病例300萬例，兩項數據皆高居全球第一。繼手術、放療、化療以后，細胞治療被稱為第四種腫瘤療法，2013年甚至被Science評為年度最有價值的科學突破之一，可以說21世紀是細胞治療的時代。

《Nature Reviews Drug Discovery》上發表的全球癌癥免疫療法分析表示，截止2021年4月16日，全球在研的活細胞治療藥物共計有2073種，其中CAR-T細胞療法新增的臨床管線高達到299條，新增幅度達到35%，在免疫細胞療法中名列前茅。中國和美國CAR-T細胞療法研發臨床試驗項目遠高于其他國家。據不完全統計，2020年，中國正在進行的臨床階段的CAR-T療法為36款，共計三百多個相關臨床項目在研。

什么是細胞培養？

細胞培養是指從動物或植物中提取細胞，然后在人工環境中進行培養以進行科學研究。最早的細胞培養技術是在100多年前開發的，為科學的巨大突破做出了貢獻。如今，它已成為全世界實驗室用于研究細胞的生理學、生物化學、疾病潛在機制以及藥物和有毒化合物的作用的基本工具。它也可用于在藥物篩選和大規模制造生物化合物，諸如疫苗和治療性蛋白質。

細胞所需的基本設備和試劑

要進行需要細胞培養工作的研究并進行基本的細胞培養方案，下表1和表2匯總了一些關鍵設備和一些基本試劑。

細胞培養所需的基本試劑
 

其他設備包括在層流罩中的抽吸泵，可輕松地從細胞培養容器中去除培養基和試劑；用于對設備和可重復使用玻璃器皿進行消毒的高壓滅菌器；注射器，針頭和鑷子；計時器 、75％乙醇噴霧瓶和紙巾卷，用于對表面和設備進行消毒；膠帶和用于標記的永久性標記記號筆；管架和廢物箱等。

細胞培養所需的基本試劑

細胞培養基礎

對于細胞存活和生長，至關重要的是培養環境盡可能復制細胞的生理環境�？梢钥刂频呐囵B條件包括溫度、相對濕度和二氧化碳含量，以及與培養基相關的因素，例如營養成分、pH、分子滲透摩爾濃度以及補料的體積和使用頻率。這些變量會隨時間波動，因此應對其 進行監視。下表3突出顯示了大多數哺乳動物細胞培養的最佳培養條件，但有些細胞確實存在例外。

大多數哺乳動物細胞的最佳細胞培養條件

原代細胞與永生細胞

原代細胞培養是直接從完整或分離的組織或器官片段中分離并在培養皿中生長的細胞。首次將原代培養物進行傳代培養后，它就被稱為細胞系。原代細胞系的壽命有限，在達到衰老狀態（細胞分裂停止）之前只能傳代培養10至20次。

一些細胞系的壽命沒有限制，并且具有無限的增殖能力。這些細胞系被稱為連續的或永生的細胞系。細胞的永生化可以多種方式發生。癌細胞具有固有的突變，使細胞能夠不受限制地繁殖。最初具有有限壽命的正常細胞可以通過促進生長的基因突變而轉化為永生化細胞。通過化學處理或引入可激活生長促進基因的致瘤病毒，也可使在培養物中生長的正常細胞永生。下圖1顯示了從原代到轉化后連續細胞系的進化以及每個階段的理論細胞產量。

原代細胞到連續細胞系的進化和理論細胞產量

細胞培養冷凍保存和復蘇

細胞系是寶貴的資源，因此保存庫存以進行長期存儲至關重要。冷凍保存是指在非常低的溫度下冷卻和保存細胞以保持其生存能力的過程。細胞庫適合在低于-130°C的溫度下長期保存。

冷凍保存培養細胞的最佳方法是在冷凍保護劑（例如DMSO）存在的情況下，將它們保存在完全培養基中的液氮中。防凍劑降低培養基的凝固點，還可以降低冷卻速度，從而大大降低形成冰晶的風險，而冰晶可能損壞細胞并導致細胞死亡。細胞應以高濃度（例如90％融合時）和最早的傳代次數進行冷凍保存。簡而言之，冷凍保存包括洗滌和沉淀細胞，將其重懸于含有DMSO（例如5％DMSO）的完全培養基中，并將細胞懸浮液轉移至1mL無菌冷凍管中。由于細胞必須緩慢冷凍，因此將冷凍管放置在可控速率的冷凍室或冷凍室中。將冷凍冷凍的容器在-50至-80°C的溫度下儲存24小時，然后將冷凍管轉移到液氮儲存器中。

確切的冷凍條件取決于使用的細胞系。檢查特定于細胞系的條件非常重要，否則冷凍的種子細胞在復蘇和再培養時可能不會產生活細胞。

為了從液氮儲存中恢復細胞系，將冷凍的小瓶在便攜式液氮容器或干冰中運輸到細胞培養區域。冷凍小管中的DMSO一旦融化，會對細胞產生毒性，因此，為確保高細胞活力，必須在37°C水浴中迅速融化細胞，并立即將其轉移到裝有預熱培養基的培養皿中。培養基稀釋了DMSO，因此細胞不再處于有毒濃度。一旦復蘇的細胞繁殖并傳代兩次，它們就可以用于實驗。比較好的法是盡快冷凍儲存更多細胞，并更換長期存儲的細胞。

細胞治療產品生產過程中的污染控制建議

在細胞治療產品（如CAR-T細胞）生產過程中，鑒于供體的可變性及可能含有傳染性疾病的病原體，且培養過程易導致污染，故尤其關注防止顆粒及微生物污染。特別是在細胞治療產品上游的關鍵工藝，在設計工藝流程時，建議設計一個封閉的、或功能封閉的制造過程，以降低產品污染的風險。在細胞治療產品的整個生產過程中，對潔凈環境的控制、一次性系統的使用、對生產及培養設備的選擇等更是有著嚴格的合規要求。

摒棄型工藝解決方案

首先，可選擇使用拋棄型工藝解決方案，可以降低微生物污染和交叉污染的風險，滿足無菌化的要求。直接接觸細胞治療產品的無菌耗材應當盡可能使用一次性材料，并且所使用的耗材必須要經過嚴格的篩選，在開展耗材適用性和生物安全性評估，以及基于風險評估開展充分的耗材相容性和密封性的研究后，才能投入生產中使用。

生產及培養設備污染防控

再者，對于生產及培養設備來說，更加需要嚴格把關。比如設備的外表面應易清潔，盡量沒有清潔死角，同時耐受消毒劑及滅菌劑；其次，設備使用時應兼具產品及使用者的生物安全需求；最后設備運行過程和操作過程中，應降低甚至避免對潔凈室的潔凈環境的影響，確保生產環境符合要求。

置于產品生產環境中的CO2培養箱，可以為細胞提供穩定的培養環境條件，保障產品的質量。培養箱的開關門及排風均會對其放置的周邊潔凈環境有一定影響，建議在前端設備選型時注意，并在設備進入到使用環境后注意維護及控制，從而保證設備不會對外部潔凈環境造成破壞。特別注意的是培養箱內部的環境建議等同于B級潔凈環境，使得開閉門時內外潔凈級別一致，同時設備運行過程散發的排風顆粒應在硬件設計上有所控制，使其滿足使用環境的需求。