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AbbVie靶向蛋白降解IRAK3靶點成藥性研究進展講解

瀏覽次數:2825 發布日期:2022-6-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
對傳統小分子抑制劑,假激酶IRAK-3是比較難成藥性靶標。AbbVie公司科學家利用CRISPR/Cas9技術和PROTAC蛋白降解技術選擇性敲除或降解單核細胞衍生的樹突狀細胞中IRAK3,導致1L-12p40表達增加,誘導 T 細胞反應并導致腫瘤生長抑制,IRAK3可能成為蛋白降解劑研究的新靶點。

白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs)蛋白家族由IRAK1、IRAK2、IRAK3(IRAK-M)和IRAK4四種同工酶組成,介導白細胞介素1受體(IL-1R)和Toll樣受體(TLR)信號通路;罨腡LR/IL1R導致Myddosome組裝,這是一種由MyD88、IRAK4和IRAK2組成的多蛋白復合物,它通過 IRAK4 依賴性磷酸化激活絲氨酸/蘇氨酸激酶 IRAK1。IRAK1 與 E3 泛素連接酶 TRAF6 結合,后者介導 IKK 復合物的激活,導致 NF-κB 靶基因的轉錄。IRAK1/TRAF6 復合物還可以通過組裝具有催化活性的 TAB2-TAB3-TAK1 復合物來激活 JNK 和 p38 信號傳導。在單核細胞和巨噬細胞中,IRAK3 通過抑制 IRAK4 和 IRAK1 的激活負向調節 IRAK 信號傳導。


 

IRAK1和IRAK4是組織中廣泛表達的經典激酶,而IRAK3是一種假激酶,只在骨髓細胞系中表達,缺乏激酶活性。迄今為止,沒有傳統小分子抑制劑靶向IRAK3,2020年,Degorce等報道了第一個選擇性降解IRAK3靶點的PROTAC分子,但相關研究沒有揭示降解后功能變化。IRAK3作為TLR通路的負調控因子,可能會降低先天免疫反應。在腫瘤微環境中,敲除IRAK3顯示骨髓細胞功能增強以促進抗腫瘤響應。與腫瘤細胞共培養的單核細胞顯示 TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表達降低,但 IRAK3 表達增加。相反,與野生型 (WT) 樹突狀細胞(DCs) 相比,IRAK3-/-小鼠樹突狀細胞的促炎細胞因子表達增加,從而誘導 T 細胞反應并導致腫瘤生長抑制,降解IRAK3可能成為免疫腫瘤治療中一個有吸引力新策略。IL-12是由活化的樹突狀細胞和巨噬細胞產出的主要促炎細胞因子,通過誘導促IFN-γ細胞因子,在促進Th1介導的抗腫瘤反應、T細胞活化和增殖中發揮重要作用。

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術和PROTAC選擇性降解IRAK3來研究后續DCs中功能和表型變化。根據下圖在人單核細胞衍生的樹突狀細胞中基因編輯敲除IRAK3基因,采用基于毛細管電泳技術的Digital Western(也稱為Simple Western Wes系統)驗證基因敲除效率,2個供體顯示完全敲除,另一個顯示保留10% IRAK3蛋白表達,結果顯示通過CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表達水平。敲除了IRAK3后,在脂多糖(LPS)刺激后,通過檢測細胞上清液中細胞因子分泌水平,結果顯示IL-12p40分泌顯著增加,與對照相比,濃度增加了1.5到2倍。同時IL-12p70分泌也具有增長趨勢,但IL-10沒有影響。

通過系列體外實驗,篩選到一個選擇性降解IRAK3的PROTAC苗頭化合物,D-1。無論有無LPS刺激時,采用D-1處理原代人DCs都可實現濃度依賴性IRAK3選擇性降解,24h實現最大降解活性。進一步檢測分泌細胞因子濃度水平變化,在100 ng/mL LPS刺激時,IL-12p40細胞因子濃度隨著降解劑濃度依賴性增加。
 

 

采用PROTAC D-1和LPS處理的DCs中IL-12p40濃度增加與CRISPR/Cas9 KO實驗結果一致的,證明了兩種方法有效性,證明通過PROTAC蛋白降解劑對IRAK3靶點可成藥性。通過深入了解研究IRAK3生物學,擴大了PROTAC分子降解靶點庫,并支持了潛在治療靶點的基因編輯缺失和化學降解之間的相關性。
 

本研究主要利用Digital Western Blot技術檢測IRAK3靶蛋白表達水平,研究CRISPR/Cas9基因編輯技術和PROTAC蛋白降解技術處理后細胞蛋白表達,準確定量靶向蛋白降解研究過程量效關系。AbbVie公司研究再次證明了Digital Western Blot可快速地、可重復性精準定量內源性蛋白質表達,是PROTAC技術平臺構建的必備技術。

 

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 注冊商標,其他商標和注冊商標是其各自所有者的財產。

 

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參考文獻

1. Rhyasen, G., Starczynowski, D. IRAK signalling in cancer. Br J Cancer 112, 232–237 (2015).

2. Ann Rowley, Brian S Brown, etc. Targeting IRAK3 for Degradation to Enhance IL-12 Pro-inflammatory Cytokine Production.ACS Chem Biol. 2022 May 17

發布者:ProteinSimple
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