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全基因組CRISPR篩選識別肝星狀細胞中TGF-β誘導的肝纖維化驅動因素

瀏覽次數:2372 發布日期:2022-7-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負


當前生物醫藥行業面臨著藥物靶點同質化嚴重的問題,確認疾病的作用機制并尋找全新的、有效的、安全的藥物靶點將成為轉化醫學和創新藥物開發的有效措施,基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。
 

CRISPR / Cas9已成為一種流行的基因編輯工具,因為它易于使用,并且與其他基因調節工具(例如siRNA技術)相比,脫靶效應更少。CRISPR/Cas9敲除篩選文庫的形式主要有混合文庫和陣列文庫,已被廣泛用于靶點識別和機制分析。雖然混合文庫的 CRISPR/Cas9 篩選通常更便宜且耗時更少,但陣列式 CRISPR/Cas9 篩選在終點功能分析中提供了更多的技術靈活性。此外,與混合文庫的 CRISPR 方法相比,陣列式 CRISPR/Cas9 篩選的基因型-表型相關性通常更加直接。
 

全基因組CRISPR篩選以識別人肝星狀細胞中TGF-β誘導的肝纖維化的驅動因素

2022年3月11日,Takeda公司的開發團隊在ACS Chem Biol上發表題為Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章,為了進一步了解肝纖維化的驅動機制,作者開發了一個高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺來鑒定肝星狀細胞(HSC)來源的TGF-β誘導的肝纖維化。該研究描述的功能基因組學表型篩選平臺揭示了TGF-β誘導的肝纖維化的新生物學機制和肝纖維化的潛在藥物靶點。
 

作者使用ACTA2蛋白表達作為HSC激活的水平,首先確認了HSC對TGF-β的反應,并確認了進行CRISPR/Cas9的最佳轉染條件,包括電脈沖參數,crRNA及tracrRNA濃度,轉染的細胞數,鋪板密度等。
 


隨后按照以下工作流程使用陣列式全基因組CRISPR/Cas9進行高通量篩選敲除潛在靶基因,通過計算ACTA2表達的抑制百分比及細胞活率,最終從19,027個基因中篩選出了52個基因,其中部分基因為已經被預測可以通過傳統的小分子和抗體藥物來調節干預。
 


為了確認這些基因在改善HSC纖維化方面的作用,作者在HSC中單獨敲除了這些基因,并評估這些基因的缺失對TGF-β誘導的14種生物標志物轉錄譜的影響。
 


同時,構建器官型肝模型進行共培養,評估纖維化模型中上述基因的表達水平。與GEO profiles數據庫中發布的公開可用的轉錄組數據進行對比分析。結果進一步支持了作者篩選的基因在肝纖維化發病過程中對HSC的潛在調控作用。
 


對生物標志物轉錄譜影響的實驗中,作者發現PSMC2的缺失可以抑制多個標志物,并進一步確認小分子抑制蛋白酶體活性可以解決TGF-β誘導的HSC活化。
 


隨后,作者評估了小鼠肝纖維化bacTRAP試驗中候選基因的表達水平,確認了這些候選基因在HSC中特異性富集。
 

作者還在UK Biobank上進行了MAGMA分析,確認部分基因的遺傳變異可能會影響NASH和肝纖維化的生物標志物。
 

最后作者總結了這些研究的結果并對每個靶基因進行了評分。更高的分數表明該基因可能是肝纖維化的潛在靶標。
 


總之,作者通過構建肝纖維化的生理模型,通過高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺從19,027個基因中篩選出52個潛在基因可能在激活的HSC誘導的肝纖維化中起作用,通過一系列的驗證及對比并為10個基因進行評分,這些基因將為開發下一代肝纖維化療法提供了進一步可能。
 

當前生物醫藥行業面臨著藥物靶點同質化嚴重的問題,確認疾病的作用機制并尋找全新的、有效的、安全的藥物靶點將成為創新藥物開發的有效措施,基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做為遞送CRISPR/Cas9的工具,在短時間內完成全基因組CRISPR/Cas9篩選。
 

在近幾年的科學研究中,我們也看到了384-well Nucleofector可以很好的幫助客戶完成高通量CRISPR/Cas9篩選,siRNA篩選以及細菌的CRISPR-Prime編輯的工作中


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發布者:上海瑋馳儀器有限公司
聯系電話:18521301252
E-mail:xiaojing.su@weichilab.com

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