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平行生物反應器助力釀酒酵母細胞工廠高效合成人參皂苷

瀏覽次數:1608 發布日期:2022-5-19  來源:迪必爾生物
平行生物反應器應用 | 釀酒酵母細胞工廠高效合成人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)

 
人參皂苷是名貴中藥材人參中的關鍵活性物質,其中人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)在多項研究中被發現具有誘導癌癥細胞凋亡和抑制癌癥細胞增殖、侵襲和轉移等活性,是有希望能被應用到癌癥預防和治療的天然活性物質。但人參藥材中人參皂苷Rh2含量極低,不到干重的0.01%,為其商業化利用提出了挑戰。

中國科學院分子植物科學卓越創新中心/植物生理生態研究所合成生物學重點實驗室發表在《Cell Discovery》題為Synthesizing ginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiae cell factory at high-efficiency的研究論文,利用合成生物學方法高效合成人參皂苷Rh2。
 
 
該研究團隊在之前的研究中曾開發過一個酵母細胞工廠,利用該工廠從葡萄糖開始生產人參皂苷Rh2。但由于原人參二醇(PPD)的供應量低,并且關鍵的UDP-糖基轉移酶(UGT)在生物合成途徑的最后一步中表現不佳,人參皂苷Rh2產量對于商業化需求而言太低。
 

工程酵母中人參皂苷Rh2的生物合成途徑示意
 
在最新的研究中,針對第一代細胞工廠存在的問題,進一步通過甲羥戊酸通路的模塊化工程和P450表達水平的優化構建了PPD生產底盤。
 

PPD生產底盤構建
 
進一步,實驗在10 L生物反應器(迪必爾生物工程(上海)有限公司)中對生產PPD的底盤ZW04BY-RS進行了補料分批發酵。發酵在144 h內完成,最大生物量達到143.0 g/L干細胞重量(dcw)。補料分批發酵方式可以促進高細胞密度,并已被證明可以增加工程酵母中天然產物的產生(如青蒿酸和丹參酮)。


10 L生物反應器(迪必爾生物工程(上海)有限公司)

發酵過程將約0.3 L菌株ZW04BY-RS或ZWDRH2-10種子接種到10L生物反應器中的2.7 L培養基中發酵。發酵溫度設定在30°C,通過加入氫氧化銨將pH控制在5.0。溶解的氧通過改變攪拌速度或通氣量控制在30%以上。保持乙醇<0.5 g/L來控制進料速率。最終,新的酵母底盤細胞在10L補料分批發酵中可產生11.02 g/L PPD。PPD干重含量為76.9 mg/g dcw(即酵母干重的7.7%),遠高于5年人參根的總皂苷含量(2-3%)。


不同菌株在10L生物反應器中人參皂苷產量
 
基于這種高PPD生產底盤細胞,實驗建立了一系列細胞工廠來生產人參皂苷Rh2,并通過提高C3-OH糖基化效率進行了優化。再增加了UGTPg45的拷貝數,并設計了其啟動子以提高表達水平。
 

UGTPg45表達優化

進一步,實驗還篩選了來自UGTPg45直接演化的更有效和兼容的UGT生物部件。結合所有策略,最終建立了一個酵母細胞工廠,擁有目前為止最大的人參皂苷Rh2產量(10L分批補料發酵產量為2.25 g / L)。
 

UGT生物部件優化,用于改善人參皂苷Rh2產量
 

結合UGTPg45-HV和新型生物部件UGTPn50,進一步提高人參皂苷Rh2的產量
 
研究結果為改善酵母細胞工廠以生產植物稀有天然產物,特別是糖基化產物樹立了一個成功的案例。
 
參考文獻:
1. Wang, P., Wei, W., Ye, W. et al. Synthesizing ginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiae cell factory at high-efficiency. Cell Discov 5, 5 (2019). https://doi.org/10.1038/s41421-018-0075-5
 
感謝資源提供者!
 
      
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標簽: Rh2 糖基化
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