多光譜技術(shù)在種子活力及種子人工老化后質(zhì)量指標(biāo)研究上的應(yīng)用
Autofluorescence‑spectral imaging as an innovative method for rapid, non‑destructive and reliable assessing of soybean seed quality
自動(dòng)熒光光譜成像作為一種快速、無(wú)損和可靠地評(píng)估大豆種子質(zhì)量的創(chuàng)新方法
摘要：在農(nóng)業(yè)工業(yè)中，基于快速和非破壞性方法的光學(xué)成像技術(shù)的進(jìn)步有助于為不斷增長(zhǎng)的人口增加糧食產(chǎn)量。本研究采用自發(fā)熒光光譜成像和機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)開發(fā)不同的模型，用于對(duì)人工老化后生理質(zhì)量不同的大豆種子進(jìn)行分類。來(lái)自 365/400 nm 激發(fā)-發(fā)射組合的自發(fā)熒光信號(hào)（與胚胎中的總酚類表現(xiàn)出完美的相關(guān)性）能夠有效地分離處理。此外，還可以證明自發(fā)熒光光譜數(shù)據(jù)與幾個(gè)質(zhì)量指標(biāo)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，例如早期發(fā)芽和種子對(duì)壓力條件的耐受性。基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量機(jī)或線性判別分析開發(fā)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型在對(duì)不同質(zhì)量水平的種子進(jìn)行分類時(shí)表現(xiàn)出較高的性能（0.99 準(zhǔn)確度）。總之，我們的研究表明，大豆種子的生理潛力隨著濃度的變化而降低，并且可能在自發(fā)熒光化合物的結(jié)構(gòu)中。此外，改變種子的自發(fā)熒光特性會(huì)影響幼苗的光合作用裝置。從實(shí)用的角度來(lái)看，基于自發(fā)熒光的成像可用于檢查大豆種子組織光學(xué)特性的變化，并始終區(qū)分高活力和低活力的種子。自動(dòng)熒光光譜成像作為一種快速、無(wú)損和可靠地評(píng)估大豆種子質(zhì)量的創(chuàng)新方法
發(fā)芽率隨著種子老化而降低，尤其是在播種后 5 天（圖 1）。 雖然電導(dǎo)率（種子膜完整性的間接指標(biāo)）在老化 24 小時(shí)和 48 小時(shí)的種子中增加（圖 1），但飽和鹽加速老化（SSAA）將種子分為兩組，即種子老化 0 和 12 小時(shí)與陳化 24 和 48 小時(shí)的種子。 同時(shí)，傳統(tǒng)的人工 老化（AA）進(jìn)一步從老化的種子中切下未老化的種子。 出苗試驗(yàn)無(wú)法區(qū)分種子類別（圖 1）。
圖1. 非老化大豆種子和老化 12、24 和 48 小時(shí)種子的發(fā)芽和活力測(cè)試
種子的平均自發(fā)熒光光譜在 365 至 540 nm（470 nm 除外）的激發(fā)波長(zhǎng)下較高（圖 3a）。 在 365/400 nm、405/500 nm 和 630/700 nm 激發(fā)發(fā)射組合下有效分離未老化種子； 在這些組合中，365/400 nm 提供了對(duì)種子類別最精細(xì)的區(qū)分（圖 3a）。 帶寬之間的最高相關(guān)系數(shù)為：1.00（515/600 nm 對(duì) 540/600 nm）、0.99（430/500 nm 對(duì) 450/500 nm；630/700 nm 對(duì) 645/700 nm）和 0.97（405/500 nm vs 430/500；645/700 nm vs 660/700 nm）（圖 3b）。
圖3. 使用來(lái)自不同激發(fā)-發(fā)射組合的自發(fā)熒光光譜數(shù)據(jù)比較非老化大豆種子和老化 12、24 和 48 小時(shí)的種子類別
使用 nCDA 算法，通過(guò)去除異常觀察值來(lái)轉(zhuǎn)換結(jié)合 365/400 nm 獲得的自發(fā)熒光圖像的像素值，從而可以計(jì)算修剪后的平均值。該技術(shù)有助于消除可能影響均值的異常值的影響，從而提供更真實(shí)的圖像。使用從紅色 (0) 到藍(lán)色 (256) 的假色代碼創(chuàng)建的像素到像素映射在圖像中顯示自發(fā)熒光強(qiáng)度，其中較高的像素值表示具有較高自發(fā)熒光的組織（圖 4）。盡管所有類別都顯示出相似的 RGB 圖像，但在存在種皮的情況下捕獲圖像時(shí)存在不同的自發(fā)熒光模式（圖 4a），其中老化 24 和 48 小時(shí)的種子表現(xiàn)出最低的自發(fā)熒光信號(hào)（較低的像素值） ）。然而，去除種皮后，所有種子類別都呈現(xiàn)出相似的自發(fā)熒光模式，而與老化期無(wú)關(guān)（圖 4b）。在第8天的發(fā)芽試驗(yàn)中，存在種皮的種子自發(fā)熒光信號(hào)越低，幼苗性能越低（圖4c）。
圖4. 來(lái)自大豆種子類別的非老化種子和老化 12、24 和 48 小時(shí)種子的原始 RGB 圖像，以及在 365/400 nm 激發(fā)發(fā)射組合下捕獲的熒光圖像（灰度和 nCDA），顯示存在下的自發(fā)熒光模式（a ) 和缺少 (b) 種皮。
自發(fā)熒光測(cè)量與種子質(zhì)量指標(biāo)之間的相關(guān)性。 Pearson 相關(guān)分析（圖 5）顯示 365/400 nm 組合與胚胎中總酚（- 1.00）之間存在完美的負(fù)相關(guān)，而 660/700 nm 組合與 SSAA 測(cè)試（1.00）之間存在完美的正相關(guān) . 其他帶寬的相關(guān)系數(shù)也很高：0.99（515/600 nm 或 540/600 nm vs 木質(zhì)素），- 0.99（630/700 nm vs 電導(dǎo)率；645/700 nm vs 胚胎中的總酚），0.98 (430/500 nm vs 木質(zhì)素), 0.97 (405/500 nm vs 木質(zhì)素), - 0.97 (570/600 nm vs 葉綠素 a 或葉綠素 b), 0.96 (450/500 nm vs 木質(zhì)素) 和 0.95 (470/500 納米與木質(zhì)素）。
圖5. 來(lái)自不同激發(fā)發(fā)射組合的自發(fā)熒光光譜數(shù)據(jù)與大豆種子質(zhì)量指標(biāo)之間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)
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