抗生素分類及轉染與抗性篩選
抗生素是一組用于抑制微生物生長或者殺死微生物的藥物，一般用來抑制感染，例如我們生活中十分熟悉的青霉素、紅霉素、頭孢菌素等等就是典型的抗生素。抗生素的發現大大改善了炎癥和感染，但是由于細菌變得越來越聰明，問題也隨之而來，那就是抗生素的耐藥性。
圖 1. 抗生素按照作用機制分類[1]
轉染 (Transfection) 是真核細胞主動或被動導入外源核酸片段而獲得新表型的過程，引入的遺傳物質 (DNA 和 RNA) 穩定或暫時存在于細胞中，據此，轉染可分為穩定轉染和瞬時轉染。
穩定轉染：引入的遺傳物質常帶選擇性標記基因，它們被整合到宿主的基因組中，即使在宿主細胞分裂傳代后也能維持轉基因的表達。即穩轉的細胞系通過一些選擇性標記反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。
瞬時轉染：引入的遺傳物質僅在有限的時間內表達，并且不會整合到基因組中。遺傳物質也會因環境因素和細胞分裂而丟失，瞬時轉染維持時間較短，需盡快在蛋白或基因水平進行相應的檢測。
圖 2. 兩種不同的轉染方式[4]
A. 穩定轉染; B. 瞬時轉染
關于抗生素抗性篩選：攜帶抗生素抗性標記的載體進入細胞，轉染成功的細胞在含有抗生素的選擇培養基中生長，而不帶有抗性基因的細胞會被抗生素殺死，最后獲得穩定的帶抗性細胞株。因此，抗生素抗性標記是區分穩定轉染和瞬時轉染的有效方法。
在原核/真核生物轉染實驗中常用的抗生素有很多，例如嘌呤霉素、G418、卡那霉素、四環素和博來霉素等等。
■ 嘌呤霉素 (Puromycin)
嘌呤霉素是一種氨基核苷類抗生素，是真核和原核生物中蛋白質翻譯的有效抑制劑。如圖 3 所示，嘌呤霉素通過模擬氨酰化 tRNA (aa-tRNA) 的 3' 末端，代替正常氨基酸參與翻譯延長過程。它通過核糖體肽基轉移酶中心 (PTC) 催化摻入新生鏈的 C 末端，阻止進一步延伸，導致翻譯過早的終止，從而抑制了蛋白質合成。
圖 3. 嘌呤霉素的作用機制[6]
編碼嘌呤霉素抗性的基因——嘌呤霉素 N-乙酰轉移酶 (PAC) 的 pac 基因，是從 Streptomyces alboniger 中分離出來的，早在 1988 年，PAC 就首次被用作分離穩定轉染的哺乳動物細胞系的顯性選擇標記。
Mikołaj Słabicki 等在 Nature 上發表的 Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6 中使用嘌呤霉素篩選抗性的 HEK293TCas9 細胞。首先將 HEK293TCas9 細胞進行慢病毒轉染，然后再用嘌呤霉素孵育進行篩選。因低濃度的嘌呤霉素對活細胞具有毒性，所以篩選后存活下來的細胞即具有嘌呤霉素抗性。Yunhao Chen 等在 Mol Cancer 上發表的 WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1 中，也是選取了 4 個細胞系，在用慢病毒轉染后，用嘌呤霉素感染細胞 1 周或更長時間，通過 RT-qPCR 和 WB 分析確定轉染的效率。
圖 4. 嘌呤霉素抗性細胞篩選過程
■ G418
G418，一種氨基糖苷類抗生素，由細菌 Micro-monospora rhodorangea 產生，其結構與新霉素、慶大霉素和卡那霉素類似。G418 的抗性是由來自 Tn5 的編碼氨基糖苷 3'-磷酸轉移酶 APH 3' II 的新霉素抗性基因 (neo) 介導的。與只對原核生物有作用的新霉素不同，G418 對細菌、酵母、原生動物、蠕蟲和哺乳動物細胞均具有廣泛的毒性。G418 與細胞中的 70S 或者 80S 核糖體進行不可逆的結合，抑制蛋白質延伸，進而阻斷了多肽的合成。
圖 5. G418 抗性細胞篩選過程[14]
注: 只有經轉座子 Tn5 或 Tn601 的 neo 基因轉染的細胞可獲得對 G418 的抗性；G418 的有效濃度因細胞的生長培養基、培養條件和代謝率而異。■ 卡那霉素 (Bekanamycin)
卡那霉素，一種廣譜氨基糖苷類抗生素，可以從細菌 Streptomyces kanamyceticus 中分離出來。卡那霉素與 30S 核糖體亞基中的 16S rRNA 受體不可逆結合后，會影響 mRNA 密碼子向氨基酸的翻譯，引起 mRNA 的誤讀或易位抑制，從而抑制蛋白質合成(圖 6B)。
A: 核糖體中的正常翻譯過程; B: 卡那霉素 (K) 影響翻譯過程
■ 四環素 (Tetracycline)
四環素，是一種廣譜的抗生素，對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、非典型生物如衣原體、支原體和立克次體以及原生動物寄生蟲具有活性。如圖 7，四環素與細菌核糖體的 30S 亞基可逆結合，抑制氨酰-tRNA 與 mRNA-核糖體復合物的結合，即防止任何進入的氨酰基-tRNA 被信使 RNA 中的密碼子識別，從而抑制蛋白質的合成。
對四環素的抗性是通過以下幾種機制之一介導的：四環素流出、通過將特定細胞質蛋白與核糖體結合來保護四環素結合位點、四環素修飾或在四環素結合位點處對 16S rRNA 進行修飾。
圖 7. 四環素在核糖體位點結合并阻斷 tRNA 結合[20]
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參考文獻
1. Garima Kapoor, et al. Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. Jul-Sep 2017;33(3):300-305.
2. Wanda C Reygaert, et al. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 2018 Jun 26;4(3):482-501.
3. Vilhelm Müller, Fredrik Westerlund, et al. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci Rep. 2016 Dec 1;6:37938.
4. Tae Kyung Kim, James H. Eberwine, et al. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 2010 Aug;397(8):3173-8.
5. Jessica M A Blair, Laura J. V. Piddock, et al. Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol. 2015 Jan;13(1):42-51.
6. Ranen Aviner, et al. The science of puromycin: From studies of ribosome function to applications in biotechnology. Comput Struct Biotechnol J. 2020 Apr 24;18:1074-1083.
7. Alessandro T. Caputo, Timothy E. Adams, et al. Structure-guided selection of puromycin N-acetyltransferase mutants with enhanced selection stringency for deriving mammalian cell lines expressing recombinant proteins. Sci Rep. 2021 Mar 4;11(1):5247.
8. Mikołaj Słabicki, Eric S. Fischer, Benjamin L. Ebert, et al. Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6. Nature. 2020 Dec;588(7836):164-168.
9. Yunhao Chen, Shusen Zheng, et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1.
10. M Küng, Peter Bütikofer, et al. Addition of G418 and other aminoglycoside antibiotics to mammalian cells results in the release of GPI-anchored proteins. FEBS Lett. 1997 Jun 16;409(3):333-8.
11. R L Yenofsky, et al. A mutant neomycin phosphotransferase II gene reduces the resistance of transformants to antibiotic selection pressure.
12. Anna Sobiepanek, et al. Implementation of Geneticin in the in vitrocell culture and in vivostudies. Review and Research on Cancer Treatment. Volume 6, Issue 1 (2020)
13. Nicolas Garreau de Loubresse, Marat Yusupov, et al. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature. 2014 Sep 25;513(7519):517-22.
14. Xuping Xie, et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 2016 Oct;12:156-160.
15. REZA FARAJI, et al. Effects of kanamycin on the Macromolecular Composition of kanamycin Sensitive Escherichia coli DH5α Strain. Journal of Experimental Microbiology and Immunology (JEMI). April 2006, Vol. 9:31-38
16. Roberto Chulluncuy, et al. Conformational Response of 30S-bound IF3 to A-Site Binders Streptomycin and Kanamycin. Antibiotics (Basel). 2016 Dec 13;5(4):38.
17. António Correia, et al. Identifying Patterns on the Development of Kanamycin Resistance in Staphylococcus epidermidiswith Four-WelledPlates.
18. Chinwe U Chukwudi, et al. rRNA Binding Sites and the Molecular Mechanism of Action of the Tetracyclines. Antimicrob Agents Chemother. 2016 Jul 22;60(8):4433-41.
19. Wen Li, Joachim Frank, et al. Mechanism of tetracycline resistance by ribosomal protection protein Tet(O). Nat Commun. 2013;4:1477.
20. Koltai T. Tetracyclines against cancer. A review. 2015.
