2020年，對所有人來說都是不平凡的一年。新冠肺炎疫情（COVID-19）突如其來，改變了所有人的生活，截至2021年6月16日北京時間15:01，全球累計確診已達1.77億之多，累計死亡382萬多人。

一顆小小的冠狀病毒，竟讓整個世界為之改變。它長什么樣？在整個疫情的防控防治過程中，正是電鏡技術，讓病毒一覽無余。

負染色技術在第一時刻揭示了病毒的大概形貌，明確2020年這波疫情是由冠狀病毒引起；緊接著在清華大學李賽老師帶領下，冷凍電鏡斷層成像及子斷層圖像平均重構技術從內到外地揭示了真實新型冠狀病毒的全病毒三維結構。分辨率達7.8-11Å的高清結構，對疫苗及抗體研發(fā)、疫情防控宣傳、科普教育、分子動力學模擬等都起到了重要作用。
 

負染色技術—鑒定病毒形態(tài)

為什么是冠狀病毒？

電鏡給了一個很重要的指標：病毒形態(tài)。

2020年1月6日，中國疾控中心通過對臨床患者分離毒株樣品進行電鏡負染色，發(fā)現(xiàn)了病毒的存在，且形狀與冠狀病毒相似，直徑80-120nm，表面有皇冠一樣的突起，這就給我們一個很重要的方向指示。隨后，根據(jù)核酸序列比對以及其他鑒定方法，宣布新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)。

我國第一株新冠病毒毒種信息電鏡負染照片

負染色技術可以鑒別病毒形態(tài)、純度和濃度。負染技術流程簡單，檢測速度快。一般幾分鐘就可以完成。

載網(wǎng)要求：

1.載網(wǎng)親水：商業(yè)化載網(wǎng)表面有油脂，懸液樣品鋪不開

 載網(wǎng)輝光放電處理后，親水性增強，懸液均勻鋪開

2.碳膜載網(wǎng)：促進樣品顆粒均勻分布

徠卡高真空鍍膜儀，一機兩用：鍍膜+輝光放電

EM ACE系列鍍膜儀

負染技術—徠卡解決方案

冷凍電鏡技術—指導藥物和疫苗設計

清華大學生命學院李賽研究員課題組和浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室李蘭娟院士課題組緊密合作，利用冷凍電鏡斷層成像和子斷層平均重構技術成功解析了新冠病毒（SARS-CoV-2）全病毒三維結構，這一重要研究成果于北京時間2020年9月15日以 “新冠病毒的全分子結構”（Molecular architecture of the SARS-CoV-2 virus）為題在國際權威學術期刊《細胞》雜志上在線發(fā)表。

首次解析新冠全病毒分子結構
這項研究首次解析了新冠病毒全病毒的高分辨率分子結構，使世界對新冠病毒的認識更近一步，為抗擊疫情、治療新冠肺炎打下堅實全面的結構基礎。在這項研究中，浙大團隊提供了經(jīng)嚴格滅活、含有新冠病毒的細胞培養(yǎng)液，保證了樣品的天然結構。
清華團隊在二級實驗室提純濃縮病毒后，使用實驗室開發(fā)的高通量、高分辨冷凍電鏡斷層成像技術（cryo-ET），采集了100TB數(shù)據(jù)、篩選出2294顆病毒顆粒（目前已知的關于新冠病毒最大的cryo-ET數(shù)據(jù)集），并重構出一顆具有代表性的完整的病毒三維結構，分辨率達7.8-11Å。統(tǒng)計結果表明，新冠病毒囊膜平均直徑約80納米，表面約有30個刺突蛋白，內部約有30個核糖核蛋白復合物。

新冠病毒結構及冷凍電鏡斷層圖像

原位狀態(tài)下深度分析刺突蛋白結構
新冠病毒的“皇冠”特征，來源于它表面的刺突蛋白，凸起于病毒表面，是其侵入人體細胞的“鑰匙”，目前大多數(shù)疫苗和抗體的研發(fā)均聚焦于該蛋白。
該研究解析出處于融合前狀態(tài)及融合后狀態(tài)的三種不同構象刺突蛋白結構。結果表明，刺突蛋白在病毒表面呈隨機分布，且可自由擺動，類似于古代武器“鏈錘”，這種靈活的特性有利于“鑰匙”及時調整方向，同細胞上更多的“鎖”（受體）結合而增加侵染細胞幾率。刺突蛋白也很脆弱，滅活和提純方式不當可能導致其部分、甚至完全脫落，產(chǎn)生不正常的“禿”病毒。
刺突蛋白表面有多達66個糖基化修飾，這些糖像盾牌一樣保護病毒不被免疫識別。此前未有對病毒上天然狀態(tài)下糖基化修飾的詳細研究。在清華大學蛋白質化學與組學平臺的幫助下，該問題得到詳細解答：相比于重組刺突蛋白，原位的糖基更大也更復雜，但總體而言相似性較大，這種相似性保證了重組刺突蛋白研發(fā)疫苗工作的有效性。

全球首次從內到外完整揭示新冠病毒全病毒精細結構

開創(chuàng)性揭示核糖核蛋白復合物天然結構
新冠病毒的所有遺傳信息都編碼在其核糖核酸（RNA）上。病毒想要“繁衍”下一代，就必須保護好這根“生命之源”。冠狀病毒的RNA是所有已知RNA病毒中最長的，其直線長度可達自身直徑的100倍。如何把這根核酸“長繩”完整有序地纏繞進僅有數(shù)十納米直徑的體內，是所有病毒都要費勁兒解決的幾何難題。這個重任主要落在核蛋白上，它像線軸一樣收納RNA，將其有序纏繞，并組裝成稱為核糖核蛋白復合物（RNP）的高級結構，才能將RNA完整塞進體內。在病毒發(fā)生膜融合及去組裝后，它又能有條不紊的釋放RNA。這個包裝方法及過程，不僅對于新冠病毒是個未解之謎，甚至在所有正義單鏈RNA病毒中也是幾何謎題。

李賽課題組對病毒內近30000顆RNP進行了挑選和分析，開創(chuàng)性地展示了病毒腔內核糖核蛋白復合物結構及組裝機制。該復合物像串珠一樣將RNA組織在一起，并在病毒體內呈現(xiàn)六聚“鳥巢”型和正四面體“金字塔”型兩種局部排列，有序地收納了RNA這根“長繩”，還增加了病毒在復雜環(huán)境中經(jīng)受物理挑戰(zhàn)的能力。這是世界范圍內首次“看清”正義單鏈RNA病毒的內部結構。

這一真實的病毒三維圖像讓“看不見的敵人”清晰地展現(xiàn)在世人面前，首次讓世界看到新冠病毒全病毒結構。這一成果對疫苗及抗體研發(fā)、疫情防控宣傳、科普教育等均有重要意義。其中一位審稿人在評審意見里稱贊道：“這項工作展示了迄今為止我所見過的最完整新冠病毒形象，這也是使用冷凍電鏡斷層成像方法解析完整顆粒結構的一次絕妙的應用……”。法國科學院院士、著名結構病毒學家Felix A.Rey教授來信祝賀道：“這是一個里程碑式的工作”。

 

冷凍電鏡制樣技術路線

技術流程與負染類似，但是樣品最終要經(jīng)過投入冷凍固定，在低溫電鏡下進行觀察。

徠卡EM GP2，就是一款專業(yè)的投入冷凍儀，通過對樣品的單邊或雙邊的平行吸附，實現(xiàn)樣品的快速均勻冷凍。包括生物樣品，工業(yè)溶劑、懸濁液、乳濁液、膠體樣品等。

冷凍電鏡技術—徠卡解決方案




近年來先后暴發(fā)的病毒疫情：如埃博拉出血熱、冠狀病毒感染引起的嚴重急性呼吸綜合征、中東呼吸綜合征和新型冠狀病毒肺炎以及寨卡病毒病等，嚴重威脅了人民生命健康和社會公共衛(wèi)生安全。因此，針對尚未表征的新發(fā)病原體，尤其是針對變異速度快、宿主范圍廣、傳播能力強的病毒病原體采取有效的防控策略尤為重要。

同時，對于新發(fā)突發(fā)病毒的感染機制的研究與抗病毒藥物的開發(fā)也是必不可少的。電鏡技術可以使病毒一覽無余，徠卡提供先進的常溫/冷凍電鏡制樣技術，將一如既往協(xié)助廣大電鏡人“看清”病毒真面目。

參考內容：

清華大學生命科學學院/最新研究成果/ 重大突破！清華大學李賽團隊與浙江大學李蘭娟團隊合作解析出新冠病毒全病毒三維結構 

http://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/2465.htm

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