細胞培養(yǎng)之秘密花園篇
眾所周知，細胞培養(yǎng)中最常見的組合就是基礎培養(yǎng)基+血清了。隨著科研的深入，無血清細胞培養(yǎng)基應運而生，它添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，能減少血清帶來的不利因素，使細胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。然而在細胞培養(yǎng)中，常常被大家所忽視的細胞培養(yǎng)輔助試劑也發(fā)揮著舉足輕重的作用。今天小編就帶您來探索一下細胞培養(yǎng)的秘密花園——細胞培養(yǎng)輔助試劑。
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養(yǎng)皿結(jié)合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時細胞在自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力的作用下成為球形。
❤ 使用胰酶時需注意哪些細節(jié)問題？
在使用胰酶（Trypsins）細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差，做流式時的CD Marker也可能會下降。胰酶進行分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時液體體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。胰酶適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。
注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。
一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，這時就應該停止消化。
❤ 如何選擇正確的細胞消化試劑？
BI提供動物來源的傳統(tǒng)胰酶及基因工程生產(chǎn)的重組胰蛋白酶。
動物胰酶普遍用于血清培養(yǎng)，不同的細胞加入胰酶的成分和濃度不一樣。貼壁不牢和半貼壁細胞盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培養(yǎng)箱孵育，這樣易于控制，對細胞的傷害也降到最低。對于難消化的細胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶，而不是無限地延長消化時間。重組胰酶用于無血清培養(yǎng)。重組胰酶具有與動物源性胰蛋白酶相同的酶學性質(zhì)，但是不含任何動物源成分，可替代胰蛋白酶使用（常用于細胞治療）。
❤ EDTA和胰蛋白酶各有什么作用呢？
許多人不用胰蛋白酶，只用EDTA，或者用胰蛋白酶/EDTA聯(lián)合作用。胰酶切割ECM（負責粘連和附著的蛋白），而EDTA通過螯合Ca2+，抑制Integrin的貼壁活性，所以EDTA的作用更加溫和。
❤ 在細胞培養(yǎng)過程中，抗生素是否是必要的添加物？
答案是否定的，細胞培養(yǎng)時不應常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細胞發(fā)生交叉反應，影響細胞生化，并可能改變培養(yǎng)細胞的分化潛能，干擾研究過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段而且只能短期使用，并應盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。
❤ 原代細胞里加雙抗或者三抗，會不會影響細胞生長？
分離原代細胞初期，為了避免造成污染，一般會建議預防性加入適量雙抗或者三抗，適量的抗生素用量對細胞的生長幾乎沒有影響，可以在細胞培養(yǎng)穩(wěn)定后降低或移除抗生素。
❤ 青霉素（Penicillin）、鏈霉素（Streptomycin）的抑菌原理是什么？
青霉素通過抑制細菌細胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交連橋的結(jié)合而阻礙細胞壁合成并發(fā)揮殺菌作用，對革蘭陽性菌有效，但革蘭陰性菌缺乏五肽交連橋，因此青霉素對其作用不大。鏈霉素作用于細菌體內(nèi)的核糖體，抑制細菌蛋白質(zhì)合成，對革蘭陰性菌有效。青鏈雙抗 (Penicillin-Streptomycin Solution, Cat#：03-031-1B)聯(lián)合抑制細菌，可以有效殺滅G+、G-菌。
❤ 青鏈制真菌素三抗溶液（Penicillin-Streptomycin Nystatin Solution, Cat#：03-032-1B），融解后會有黃色物質(zhì)析出，屬于正常現(xiàn)象嗎？
三抗本身是濃縮溶液，制真霉素在高濃度飽和狀態(tài)水溶性差會被析出呈黃色物質(zhì)，溶液外觀略顯渾濁，屬于正常現(xiàn)象，可以放心使用。
❤ 如何解決L-谷氨酰胺不穩(wěn)定的問題呢？
1. 選擇不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，自己添加。
2. 選擇穩(wěn)定的谷氨酰胺替代物——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液。
❤ L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的工作原理是什么？
在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞時，細胞可逐漸釋放氨肽酶，水解二肽，緩慢釋放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培養(yǎng)基中。隨后，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被細胞吸收，用于蛋白質(zhì)生成或TCA循環(huán)。這好比是流加培養(yǎng)的策略，將L-谷氨酰胺連續(xù)加入培養(yǎng)基中，但是始終維持較低的濃度水平。結(jié)果獲得有效的能量代謝和較高的生長量，且不會生成多余的氨。
秘密花園之平衡鹽溶液篇
平衡鹽溶液篇-BI產(chǎn)品推薦
秘密花園之無血清細胞培養(yǎng)添加物篇
秘密花園之胰酶篇
使用胰酶，你必須要注意的事情
❤ 胰酶的作用原理是什么呢？使用胰酶，你必須要注意的事情
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養(yǎng)皿結(jié)合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時細胞在自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力的作用下成為球形。
❤ 使用胰酶時需注意哪些細節(jié)問題？
在使用胰酶（Trypsins）細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差，做流式時的CD Marker也可能會下降。胰酶進行分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時液體體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。胰酶適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。
注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。
一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，這時就應該停止消化。
❤ 如何選擇正確的細胞消化試劑？
BI提供動物來源的傳統(tǒng)胰酶及基因工程生產(chǎn)的重組胰蛋白酶。
動物胰酶普遍用于血清培養(yǎng)，不同的細胞加入胰酶的成分和濃度不一樣。貼壁不牢和半貼壁細胞盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培養(yǎng)箱孵育，這樣易于控制，對細胞的傷害也降到最低。對于難消化的細胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶，而不是無限地延長消化時間。重組胰酶用于無血清培養(yǎng)。重組胰酶具有與動物源性胰蛋白酶相同的酶學性質(zhì)，但是不含任何動物源成分，可替代胰蛋白酶使用（常用于細胞治療）。
❤ EDTA和胰蛋白酶各有什么作用呢？
許多人不用胰蛋白酶，只用EDTA，或者用胰蛋白酶/EDTA聯(lián)合作用。胰酶切割ECM（負責粘連和附著的蛋白），而EDTA通過螯合Ca2+，抑制Integrin的貼壁活性，所以EDTA的作用更加溫和。
胰酶篇-BI產(chǎn)品推薦
普通胰酶：
特殊胰酶：
溫馨提示：重組胰酶室溫保存即可噢~
秘密花園之抗生素篇
使用抗生素，你必須要注意的事情
❤ 在細胞培養(yǎng)過程中，抗生素是否是必要的添加物？
答案是否定的，細胞培養(yǎng)時不應常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細胞發(fā)生交叉反應，影響細胞生化，并可能改變培養(yǎng)細胞的分化潛能，干擾研究過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段而且只能短期使用，并應盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。
❤ 原代細胞里加雙抗或者三抗，會不會影響細胞生長？
分離原代細胞初期，為了避免造成污染，一般會建議預防性加入適量雙抗或者三抗，適量的抗生素用量對細胞的生長幾乎沒有影響，可以在細胞培養(yǎng)穩(wěn)定后降低或移除抗生素。
❤ 青霉素（Penicillin）、鏈霉素（Streptomycin）的抑菌原理是什么？
青霉素通過抑制細菌細胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交連橋的結(jié)合而阻礙細胞壁合成并發(fā)揮殺菌作用，對革蘭陽性菌有效，但革蘭陰性菌缺乏五肽交連橋，因此青霉素對其作用不大。鏈霉素作用于細菌體內(nèi)的核糖體，抑制細菌蛋白質(zhì)合成，對革蘭陰性菌有效。青鏈雙抗 (Penicillin-Streptomycin Solution, Cat#：03-031-1B)聯(lián)合抑制細菌，可以有效殺滅G+、G-菌。
❤ 青鏈制真菌素三抗溶液（Penicillin-Streptomycin Nystatin Solution, Cat#：03-032-1B），融解后會有黃色物質(zhì)析出，屬于正常現(xiàn)象嗎？
三抗本身是濃縮溶液，制真霉素在高濃度飽和狀態(tài)水溶性差會被析出呈黃色物質(zhì)，溶液外觀略顯渾濁，屬于正常現(xiàn)象，可以放心使用。
抗生素篇-BI產(chǎn)品推薦
秘密花園之細胞凍存液篇
細胞凍存，你必須要注意的事情
❤ 能長期將細胞保存在-20°C / -80°C嗎?
與任何冷凍溶液一樣，在Nutrireez™D10培養(yǎng)基中長期低溫保存在-196°C或液氮中最有效。由于長時間暴露于DMSO中，在-20°C / -80°C中存儲可能會影響細胞活力，而在液氮(-196°C)中保存細胞可以改善這一影響。
❤ 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。
❤ 為什么需要無動物成分(ACF)細胞凍存溶液?
血清是一個“黑匣子”，它包含了許多不需要低溫保存的成分，甚至可能在冷凍和解凍過程中傷害細胞。ACF溶液除了可重復性和一致性外，還能提高活力和回收率。
與任何冷凍溶液一樣，在Nutrireez™D10培養(yǎng)基中長期低溫保存在-196°C或液氮中最有效。由于長時間暴露于DMSO中，在-20°C / -80°C中存儲可能會影響細胞活力，而在液氮(-196°C)中保存細胞可以改善這一影響。
❤ 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。
❤ 為什么需要無動物成分(ACF)細胞凍存溶液?
血清是一個“黑匣子”，它包含了許多不需要低溫保存的成分，甚至可能在冷凍和解凍過程中傷害細胞。ACF溶液除了可重復性和一致性外，還能提高活力和回收率。
細胞凍存液篇-BI產(chǎn)品推薦
秘密花園之谷氨酰胺篇
❤ L-谷氨酰胺(L-Glutamine)在細胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
L-谷氨酰胺是細胞培養(yǎng)中細胞進行能量生成以及蛋白質(zhì)和核酸合成所必需的一種營養(yǎng)素。L-谷氨酰胺不穩(wěn)定，在中性溶液中會自發(fā)降解，降解率隨保存溫度而變。細胞培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺降解后生成的副產(chǎn)物是氨和焦谷氨酸，而氨對于一些細胞具有毒性（對干細胞，原代細胞的影響尤其大）。
L-谷氨酰胺是細胞培養(yǎng)中細胞進行能量生成以及蛋白質(zhì)和核酸合成所必需的一種營養(yǎng)素。L-谷氨酰胺不穩(wěn)定，在中性溶液中會自發(fā)降解，降解率隨保存溫度而變。細胞培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺降解后生成的副產(chǎn)物是氨和焦谷氨酸，而氨對于一些細胞具有毒性（對干細胞，原代細胞的影響尤其大）。
❤ 如何解決L-谷氨酰胺不穩(wěn)定的問題呢？
1. 選擇不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，自己添加。
2. 選擇穩(wěn)定的谷氨酰胺替代物——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液。
❤ L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的工作原理是什么？
在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞時，細胞可逐漸釋放氨肽酶，水解二肽，緩慢釋放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培養(yǎng)基中。隨后，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被細胞吸收，用于蛋白質(zhì)生成或TCA循環(huán)。這好比是流加培養(yǎng)的策略，將L-谷氨酰胺連續(xù)加入培養(yǎng)基中，但是始終維持較低的濃度水平。結(jié)果獲得有效的能量代謝和較高的生長量，且不會生成多余的氨。
△ L-谷氨酰胺以一種可控的方式從培養(yǎng)基輸送到細胞
谷氨酰胺篇-BI產(chǎn)品推薦
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貨號 |
名稱 |
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03-020-1 |
L-Glutamine Solution (200 mM) 谷氨酰胺 |
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03-022-1 |
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) 穩(wěn)定型谷氨酰胺 |
秘密花園之平衡鹽溶液篇
平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成；它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)；同時用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。如：HEPES溶液。
❤ HEPES溶液的具體作用？什么時候需要添加HEPES溶液？
HEPES是一種兩性離子有機緩沖液，也用于維持細胞培養(yǎng)基的生理pH值。HEPES廣泛應用于許多生化反應中，并在一些細胞培養(yǎng)基中作為緩沖劑。HEPES對細胞沒有營養(yǎng)價值。當細胞培養(yǎng)需要在CO2培養(yǎng)箱外進行長時間的操作時，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時需要添加HEPES。神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)的過程中能用到。
❤ HEPES溶液的具體作用？什么時候需要添加HEPES溶液？
HEPES是一種兩性離子有機緩沖液，也用于維持細胞培養(yǎng)基的生理pH值。HEPES廣泛應用于許多生化反應中，并在一些細胞培養(yǎng)基中作為緩沖劑。HEPES對細胞沒有營養(yǎng)價值。當細胞培養(yǎng)需要在CO2培養(yǎng)箱外進行長時間的操作時，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時需要添加HEPES。神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)的過程中能用到。
平衡鹽溶液篇-BI產(chǎn)品推薦
秘密花園之無血清細胞培養(yǎng)添加物篇
無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比較，無血清培養(yǎng)基是不含動物血清，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、增殖的一種培養(yǎng)基。大多數(shù)細胞在基礎培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)時都不能增殖，它們需要補充額外的生長因子和細胞因子，如激素、轉(zhuǎn)運蛋白、微量元素或ECM因子。
激素，胰島素作為一種多肽激素，對哺乳動物細胞具有多效合成作用，促進葡萄糖和氨基酸攝取、脂肪生成、單價陽離子和磷酸轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)和核酸合成。轉(zhuǎn)運蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白作為鐵的載體，也有助于降低氧自由基和過氧化氫的毒性水平。ECM因子是某些貼壁生長細胞所必需的組分，如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白等。
激素，胰島素作為一種多肽激素，對哺乳動物細胞具有多效合成作用，促進葡萄糖和氨基酸攝取、脂肪生成、單價陽離子和磷酸轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)和核酸合成。轉(zhuǎn)運蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白作為鐵的載體，也有助于降低氧自由基和過氧化氫的毒性水平。ECM因子是某些貼壁生長細胞所必需的組分，如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白等。
無血清細胞培養(yǎng)添加物-BI產(chǎn)品推薦
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貨號 |
產(chǎn)品 |
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05-750-1 |
人纖維粘連蛋白 |
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41-951-100 |
轉(zhuǎn)鐵蛋白（不含鐵） |
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41-952-100 |
轉(zhuǎn)鐵蛋白（鐵離子飽和） |
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41-975-100 |
人類重組胰島素 |
胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-Selenious Acid（ITS）通過補充常見營養(yǎng)物質(zhì)，可以大幅度降低細胞對胎牛血清的需求。在胎牛血清濃度低于4%的情況下，ITS或ITS-E都能促進各種貼壁細胞的生長。研究表明，下列所述補充成分能被大多數(shù)哺乳動物細胞所利用。它們能促進細胞增殖，降低多種細胞對血清的需求。據(jù)文獻資料，細胞培養(yǎng)過程中，當ITS或ITS-E與2%-4%的血清一起使用時，可達到與添加10%血清相似的增殖效果。
無血清細胞培養(yǎng)添加物-VivaCell產(chǎn)品推薦
跟著小編探索完細胞培養(yǎng)秘密花園的您，是不是豁然開朗了~
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