實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過測定RNA的轉(zhuǎn)錄水平來評估基因的活力。RNA樣本提取的質(zhì)量直接影響基因表達(dá)分析。影響RNA品質(zhì)的因素有以下三種：RNA濃度、RNA純度和RNA完整性。

檢測RNA濃度、純度和完整性的方式主要有以下幾種：

紫外分光光度計(jì)法：

測量260nm吸收值計(jì)算RNA濃度，測量260nm/280nm吸收值的比值，用于評估RNA純度。需要注意的是：在檢測核酸物質(zhì)時(shí)應(yīng)該在固定的PH溶液中進(jìn)行。

260nm/280nm的比值范圍在 1.9~2.1 之間。＜1.9，說明有蛋白質(zhì)殘留；＞2.1，說明RNA可能發(fā)生降解。

瓊脂糖凝膠電泳：

完整的RNA通常有三條帶，最亮的是28S條帶，其次是18S條帶，最淡的是5S條帶（部分試劑盒提取時(shí)會(huì)過濾掉5S條帶）。通過瓊脂糖凝膠電泳可以檢測28S和18S的比值。該方法主要用于檢測RNA的純度和完整性。

如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利，28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量最好。

若RNA條帶出現(xiàn)彌散，原因可能：RNA被核酸酶降解、電壓或電流過大、上樣量過高或過低等。

上述兩種方法在實(shí)驗(yàn)室比較常用，此外還有幾種檢測方式供大家選擇。

熒光染料檢測：

通過熒光染料和RNA結(jié)合，熒光活性增強(qiáng)。此方法的靈敏度較高，主要用于檢測RNA的濃度。

微毛細(xì)管電泳：

可使用軟件的RIN（RNA Integrity Number）分?jǐn)?shù)評估，10為RNA完整性最好，0為最差。此方法的靈敏度和分辨率較高，可用于檢測RNA濃度、純度和完整性。

3’-5’完整性檢測：

是在一個(gè)RNA樣本中檢測GAPDH mRNA的完整性來代表所有RNA的完整性，主要用于檢測RNA的完整性。

得到高品質(zhì)RNA的小建議：

1、盡量避免RNA酶污染，使用無RNA酶的耗材和試劑，建議將擴(kuò)增前后的場所分開。

2、盡量減少采樣時(shí)間，樣品處理后快速冷凍，可以加入RNA保護(hù)劑。

3、RNA提取過程中可以使用RNA酶抑制劑。

4、存儲(chǔ)過程中避免反復(fù)凍融。

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