熒光定量Western Blot，絕對不是上樣量越多越好。可靠的Western Blot印跡數據通過加載適當量的樣品才能獲得。加載過多的蛋白會導致信號飽和或用于檢測的熒光基團的自猝滅。

那么，您如何知道要加載多少裂解液呢？首先使用BCA或Bradford等蛋白測定方法測量裂解液樣品的濃度。一旦知道樣品的濃度，便可以確保每種樣品的加載量相同。

于此同時，您仍然需要一種方法來校準凝膠加載量和轉印效率的問題。蛋白印跡定量的最佳方法和新共識是將蛋白進行歸一化。許多期刊都接受了總蛋白質歸一化（TPN），有些期刊（例如《JBC》）甚至要求作者在Western印跡的定量數據時使用TPN或使用驗證過的看家蛋白進行歸一化。

在下面的實驗中，加載了0.2-50µg的HeLa裂解物，以檢測靶標蛋白STAT3與內參對照GAPDH和總蛋白膜染色的性能。盡管Total-PVDF膜染色線性最高至50μg裂解物，但這顯然不是靶標蛋白STAT3加載的理想上樣量，因為信號在12.5μg以上不再線性。上樣控制GAPDH的歸一化提出了一個嚴重的問題，因為它在裂解物的濃度低于1µg時呈線性，因此其定量用途非常有限。

一般而言，我們建議不要加入超過20µg的裂解物，因為這通常會導致蛋白定量方面的問題。為了獲得最佳的熒光定量Western印跡，不要忘記應用適當的歸一化策略并加載適量的蛋白。

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☑   彩色蛋白膠和核酸膠成像。

參考文獻：

1. Collecting and presenting data. The Journal of Biological Chemistry.

website.:http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data#blot. Accessed February 4, 2019.

2. Fosang AJ and Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. Dec. 11 2015. 290(50). 29692–29694. PMCID: PMC4705984.