四川大學生物材料工程研究中心的研究團隊在Acta Biomaterialia雜志上發表了題為“Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics”的文章，揭示了磷酸鈣陶瓷的骨誘導與巨噬細胞極化之間的關聯。這些結果不僅加深了人們對骨誘導機制的了解，也有助于設計新型的骨誘導支架。生物材料工程研究中心的肖玉梅和梁潔為共同通訊作者。

研究背景

如今，生物材料的固有骨誘導已經被廣泛接受。例如，磷酸鈣（CaP）陶瓷可以在沒有外源細胞和生長因子的非骨部位誘導異位成骨。盡管這種骨誘導作用具有巨大的臨床潛力，但其內在機制還沒有完全弄清。

骨免疫學領域的研究表明，免疫細胞在維持骨穩態和調節骨重建中起著至關重要的作用。有證據表明，免疫系統和骨骼系統共享許多調控分子，包括細胞因子、趨化因子、受體和轉錄因子。生物材料在植入后會不可避免地引發宿主反應，且炎癥程度會影響植入物的性能，特別是骨誘導性。

巨噬細胞作為固有免疫系統的第一道防線，在此過程中發揮重要的作用。它不僅具有吞噬作用，還可以分泌趨化因子和細胞因子來調節炎癥程度。此外，巨噬細胞表現出明顯的可塑性，可根據環境變化而顯示出一系列不同功能的極化表型。M1型和M2型是目前廣泛研究的兩種表型，分別具有促進炎癥以及減輕炎癥和促進細胞修復的作用。

先前有研究表明，骨科材料會影響巨噬細胞的極化。基于此，研究人員利用小鼠肌內植入模型和三種常用的磷酸鈣陶瓷材料，以證明巨噬細胞極化在材料誘導的骨形成中起著關鍵作用。

三種CaP陶瓷的骨誘導作用

在這項研究中，研究人員選擇了三種多孔結構的磷酸鈣陶瓷，包括羥基磷灰石（HA）、雙相磷酸鈣（BCP）和β-磷酸三鈣（β-TCP）。他們通過手術將多孔CaP圓柱體植入BALB/C小鼠肌肉內，并在90天后評估CaP陶瓷的骨誘導作用。少數HA樣本（2/7）和多數BCP樣本（6/7）中觀察到異位骨形成。然而，β-TCP樣本中未觀察到骨形成，其孔內充滿了纖維狀和脂肪樣組織。

為了評估免疫細胞浸潤，研究人員在植入后第7、14和21天提取樣本，并通過HE和免疫熒光染色觀察。隨著植入時間的延長，大量細胞（尤其是F4/80+ 巨噬細胞）從CaP陶瓷的表層區域（區域1）遷移到內部區域（區域3）。不過，BCP組的F4/80+ 巨噬細胞數量隨時間急劇減少，而β-TCP組中巨噬細胞的數量逐漸增加。

體內分析CaP陶瓷誘導的巨噬細胞極化

研究人員首先對組織切片進行免疫熒光染色，以研究體內巨噬細胞極化。在植入初期（第7、14和21天），β-TCP組的iNOS+ M1型巨噬細胞比例最高，而BCP組的ARG+ M2型巨噬細胞比例最高。對于β-TCP組，他們發現M1/M2比例逐漸增加，且M1型巨噬細胞數量更多，而BCP組在第7、14和21天都有更多的M2型巨噬細胞。

圖1. 在植入后對M1和M2表型標志物進行免疫熒光染色

之后，他們又利用RT-qPCR技術評估了M1型標志物（iNos）和M2型標志物（Arg）的基因表達。在第7天，BCP組的iNos和Arg mRNA表達量最低，不過到了第21天，BCP組明顯上調了Arg基因表達，并下調了iNos基因表達。這些結果表明，骨誘導能力出色的BCP陶瓷能夠誘導M2型巨噬細胞極化。相反，沒有明顯骨誘導性的β-TCP陶瓷促進了iNOS+ M1型巨噬細胞。

體外分析CaP陶瓷調控的巨噬細胞行為

為了深入了解其免疫調節特性，研究人員又在體外研究了CaP陶瓷對巨噬細胞行為的影響。他們利用掃描電鏡觀察了在三種CaP陶瓷上生長的巨噬細胞的形態。電鏡圖像表明，HA和BCP上的大多數巨噬細胞開始伸長，呈紡錘狀，而β-TCP上的大多數巨噬細胞保持球狀或橢圓狀。這些結果表明，β-TCP陶瓷抑制了巨噬細胞的擴散和伸長。

他們還利用RT-qPCR 分析和多重免疫檢測定量了炎癥相關細胞因子和趨化因子的表達。結果發現，β-TCP明顯上調了M1表型標志物的表達，促進巨噬細胞分泌IL-1β、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β。相反，BCP上調了M2表型標志物（Arg和Il10）的表達，并增加了CD206+ M2型巨噬細胞的比例。這些結果與體內研究一致，表明β-TCP和BCP分別將巨噬細胞推向M1和M2表型，而HA對巨噬細胞極化沒有偏向。

圖2. 炎性細胞因子和趨化因子的體外相對表達

此外，研究人員還分析了巨噬細胞分泌因子對成骨的影響。他們利用來自巨噬細胞/CaP上清液的條件培養基來培養骨髓間充質干細胞（BMSC）。結果表明，與純培養基相比，培養基中鈣離子和磷離子的消耗降低了BMSC的增殖。對于HA、BCP和β-TCP組，小鼠BMSC的增殖和成骨基因表達相當。本研究中的BMSC由賽業生物提供。

總的來說，這些結果表明，骨科植入物的骨誘導能力與炎癥反應密切相關，這是由植入物調控的巨噬細胞極化和功能狀態決定的。這項研究為了解生物材料的骨誘導機制奠定了基礎。它也有望幫助人們設計出骨誘導支架的新策略。