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超維景微型化三光子顯微鏡SUPERNOVA-3000隆重上市

瀏覽次數:2429 發布日期:2023-4-4  來源:超維景生物
新品發布 |微型化三光子顯微鏡SUPERNOVA-3000隆重上市
 
大腦深部區域與基本生命功能密切相關,在各種神經疾病中均觀察到深部大腦的結構和功能異常,例如帕金森病、阿爾茨海默癥、抑郁癥和強迫癥等。但在嚙齒類動物研究模型中,由于神經組織,特別是胼胝體,具有對光的高散射光學特性。如何突破成像深度極限,在自由活動動物上對距離腦表層深度>1 mm的結構進行成像存在極大的挑戰。三光子成像技術的出現將成像深度大大擴展至1500 μm,為非侵入式深腦成像帶來了曙光。
 
北京大學研發團隊最新發文Nature Methods

圖1.文章截圖Zhao, et al. (2023). Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection. Nat Methods. 10.1038/s41592-023-01777-3.[1]
 
解析腦連接圖譜和功能動態圖譜是我國和世界多國腦計劃的一個重點研究方向,但傳統的多光子顯微鏡進行常規腦成像通常需要將動物的頭部固定在臺式顯微鏡上,這嚴重限制了模式動物的自由生理狀態。為此需要打造自由行為動物佩戴式顯微成像類研究工具。

※ 2017年,北京大學程和平院士團隊成功研制第一代 2.2g微型化雙光子顯微鏡,獲取了小鼠在自由行為過程中大腦皮層神經元和神經突觸活動的動態圖像。
※ 2021年,該團隊的第二代微型化雙光子顯微鏡將成像視野擴大了 7.8 倍,同時具備獲取大腦皮層上千個神經元功能信號的三維成像能力。
※2023年2月,北京大學程和平-王愛民團隊再一次實現技術突破,將微型化探頭與三光子成像技術結合,并在 Nature Methods 發表文章 “Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection  ”。文章報道了僅2.17g的微型化三光子顯微鏡,首次實現對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經元功能成像,為揭示大腦深部結構中的神經機制開啟了新的研究范式。


圖2. 小鼠佩戴微型化三光子顯微鏡探頭
 
SUPERNOVA-3000應運而生
 
依托專業的研發團隊和深厚的技術積淀,SUPERNOVA-3000應運而生。SUPERNOVA-3000通過高度集成化、系統化、工業化設計將微型化探頭的重量控制在2.2g。搭配獨有的光學設計突破微型化顯微鏡的成像深度極限,在全球范圍內開創性構建自由行為動物深腦成像“新范式”。
 
自由行為動物非侵入式深腦成像解決方案

Go deeper
利用五階非線性效應以及穿透力更強的激發熒光(1300 nm),一舉突破此前微型化多光子顯微鏡的成像深度極限。


圖3. 熒光激發示意圖


圖4. 小鼠腦組織中散射長度的光譜分布[2]
 
顯微鏡激發光路可以穿透整個小鼠大腦皮層和胼胝體,實現對小鼠海馬CA1亞區形態及功能的直接觀測記錄。神經元鈣信號最大成像深度可達1.2 mm,血管成像深度可達1.4 mm。
 
圖5. 微型三光子顯微鏡記錄小鼠大腦皮層L1-L6和海馬CA1的結構和功能動態。CC:胼胝體。綠色代表GCaMP6s標記的神經元熒光鈣信號,洋紅色代表硬腦膜、微血管和腦白質界面的三次諧波信號。
 
More Freedom
●2.2g新型微型化探頭
微型化探頭通過新型內嵌阿貝聚光鏡復合式光學構型,體積僅2 × 1.6 × 0.9 cm3,實現飛秒激光脈沖無畸變傳輸、高質量激光匯聚、高效率熒光收集和激發。開創性的將三光子光學組件高度集成在一個微型化探頭內。同時外殼使用超輕金屬,重量僅2.2g既輕盈又堅固,搭配電動變焦模塊、定制光纖、光屏蔽GaAsP PMT,保證了對自由運動小鼠深腦神經活動的高穩定性、高分辨成像。

 
圖6. 小鼠佩戴微型化三光子探頭

●激光傳導光纖--空芯光子帶隙光纖
系列光纖均具有準單模傳輸、低損耗、低非線性、低色散、高激光器損傷閾值的特點。高效率傳輸1300 nm飛秒脈沖激光,將空間光路轉變為光纖傳輸,強抗彎折性能,使自由運動下觀察成為可能。


圖7. 空芯光子帶隙光纖截面和輸出光斑示意圖


圖8. 出口處激光脈沖時間剖面

Less damage
●非侵入式手術
深腦成像避免使用GRIN Lens,對小鼠大腦損傷更小,避免影響小鼠正常神經生理狀態
無GRIN Lens,成本更低
手術便捷,成功率更高 

●超低光毒性
散射熒光增強收集系統——深腦超低功率成像
SUPERNOVA-3000創新的使用微型阿貝聚光鏡與無限遠物鏡密接提高散射光的收集效率,李斯特微型管鏡復用簡化結構,優化光路設計,提高熒光收集效率的同時,保證了大視場分辨率。總體上,散射熒光增強收集構型使微型化顯微鏡的散射熒光收集效率實現了成倍的提升,實現了在超低成像功率下對自由運動小鼠大腦深部腦區神經元活動進行實時監測。


圖9. 散射熒光增強收集構型

基于散射熒光增強收集構型,實現全皮層鈣信號成像僅需幾個毫瓦,海馬鈣信號成像僅需要幾十毫瓦,大大低于組織損傷的安全閾值。因此,SUPERNOVA-3000可以長時間、不間斷連續觀測神經元功能活動,且不產生明顯的光漂白與光損傷。


圖10. AAV-hSyn-GCaMP6s病毒注射小鼠大腦不同深度腦區超低功率鈣成像
 
生物應用

動物自由運動成像
●行為學實驗下的小鼠頂葉后皮質 L6(PPC L6)的神經元鈣活動(成像深度650 μm)
微型化三光子顯微鏡可以搭配不同行為學實驗的深部腦區進行單細胞級的穩定高時空分辨率成像,滿足實時監測單個神經元的活動,結構變化以及不同功能神經元分類等實驗需求。


圖11. 行為學實驗下小鼠大腦PPC L6的神經元活動
 
●自由運動小鼠大腦海馬CA1亞區的神經元鈣活動(成像深度1.2 mm)
安全激光功率下通過非侵入式手術對背側海馬CA1(深度達1.2 mm)的鈣活動進行成像,監測神經元的鈣活動軌跡,并與小鼠行為視頻進行同步。


圖12. 自由運動小鼠大腦海馬CA1亞區的神經元活動
 
●長時程監測自由運動小鼠大腦海馬CA1亞區的神經元鈣活動(成像深度978 μm)
在8.35 Hz的成像速率下,進行100分鐘不間斷連續監測采集自由運動小鼠大腦海馬CA1亞區神經元活動,鈣信號瞬態特征無明顯變化(平均振幅,衰減時間常數,SNR)


圖13. 100分鐘不間斷采集自由運動小鼠大腦海馬CA1亞區神經元活動
 
小鼠大腦組織3D重構
 
 
國際影響--Nature Methods 發表社評

圖14. 文章部分截圖Benjamin F. Grewe et al. Nat. Methods https://doi.org/10.1038/s41592-023-01808-z [3]
 
3月,Nature Methods期刊邀請Benjamin F. Grewe等領域專家發表在線社評文章Deep brain imaging on the move ,特別指出微型化三光子顯微鏡對于深腦成像的重要意義。三光子成像則將可到達的成像深度大大擴展至1500 μm。因此,在小鼠中,微型化三光子顯微鏡將直接實現對整個大腦皮層及下方區域,例如海馬CA1進行成像,同時保留完整的大腦皮層結構投影。隨著微型化三光子顯微鏡SUPERNOVA-3000的出現,神經科學的研究人員將可實現對例如涉及紋狀體結構的,大腦皮層及皮層下方腦區之間的神經網絡進行深入研究
 

圖15. 微型化三光子顯微鏡SUPERNOVA-3000示意圖
 
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【參考文獻】
[1]Zhao, C., Chen, S., Zhang, L., Zhang, D., Wu, R., Hu, Y., Zeng, F., Li, Y., Wu, D., Yu, F., et al. (2023). Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection. Nat Methods. 10.1038/s41592-023-01777-3.
[2]N. G. Horton, K. Wang, D. Kobat, C. G. Clark, F. W. Wise, C. B. Schaffer, and C. Xu, Nature Photonics 7, 205- 209 (2013)
[3]Lecoq, J.A., Boehringer, R., and Grewe, B.F. (2023). Deep brain imaging on the move. Nat Methods. 10.1038/s41592-023-01808-z.
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