昊諾斯第17期分享討論:研磨提取核酸、微生物

瀏覽次數：4097　發布日期：2016-12-5　來源：本站　本站原創，轉載請注明出處

第17期分享討論：小鼠內臟組織樣品研磨提取核酸、微生物（文末有彩蛋）

本周昊諾斯第17期組織研磨和樣品處理分享、討論，我們邀請到了實驗動物監測所袁老師給大家分享，內容是——小鼠內臟組織樣品研磨提取核酸、微生物。

那接下來，就讓我們先睹為快，看看這個案例的情況。

實例1：加裂解液直接勻漿（使用Trizol提取組織RNA）

1、取適量組織裝入離心管，組織盡量剪碎成小塊；

2、在離心管中加入氧化鋯珠數顆（一次性使用）；

3、先加入Trizol（不建議加入太多 Trizol，液體體積過大影響勻漿效果），蓋好管蓋，裝入鼎昊源TL2020組織研磨儀適配器中，安裝上機。

4、組織研磨儀研磨參數設置為一定轉速，研磨時間為2~5min（不同組織研磨時間不同，腦1min，肝臟、脾臟和腎臟2min、肺臟比較難研磨需3~5min，可能更長，中間應停頓1~2次防止溫度過高，研磨前最好先用液氮或放置在-80度冰箱預冷）；

5、再加入適量Trizol至總體積；

6、后面步驟按Trizol說明進行。

實例2：先勻漿，再取一定量液體加裂解液進行核酸抽提，本protocol適用提取小鼠組織中的病毒的核酸

1、取適量組織裝入離心管，組織盡量剪碎成小塊，樣品量較多時使用大離心管；

2、在離心管中加入氧化鋯珠數顆，使用大離心管時，可以將氧化鋯珠數量增加；

3、加入適量的滅菌PBS或生理鹽水，總體積為離心管單管體積的1/3~1/2為好，蓋好管蓋，裝入鼎昊源TL2020組織研磨儀適配器中，安裝上機（研磨前最好先用液氮或放置在-80度冰箱預冷）。

4、組織研磨儀研磨參數設置為一定轉速，研磨時間為1~5min（不同組織研磨時間不同，腦1min，肝臟、脾臟和腎臟2min、肺臟比較難研磨需3~5min，可能更長，中間應停頓1~2次防止溫度過高），若研磨不充分，可以繼續研磨到充分為止；

5、一定溫度、轉速，離心數分鐘；

6、取上清液按照試劑盒說明書進行后續提取步驟。

實驗1中，我們之前試過一齊加1ml的Trizol，可能是體積過大，反而勻漿效果不好，所以就改成先加一部分裂解先勻漿，然后再補齊1ml體積。

昊諾斯嘉賓：實驗1中，我們之前試過一齊加1ml的Trizol，可能是體積過大，反而勻漿效果不好，所以就改成先加一部分裂解先勻漿，然后再補齊1ml體積。

昊諾斯嘉賓：如果前面勻漿充分了，后面補齊裂解后不需要再研磨的，只需稍微混勻就可以。

用戶：可以選擇干磨嗎？就組織直接扔進去弄成勻漿或者粉末，我再根據需要加trizol或者蛋白裂解液

昊諾斯嘉賓：跟大家分享下，我們最近用組織研磨儀用于抗原加佐劑的乳化，效果還不錯。一機兩用。

昊諾斯嘉賓：組織干磨效果不好，需要加入適量的液體，沒有液體很多組織掛在壁上。

用戶：提取下的核酸用途是什么？這個是我最關心的。

昊諾斯嘉賓：我們用于病原微生物檢測。

用戶：怎么個檢測法您能給我簡單介紹一下嗎？

昊諾斯嘉賓：所以我們用的最多的是實驗2，先勻漿，破碎組織，釋放組織細胞中的病毒，。

昊諾斯嘉賓：主要采用PCR為基礎的分子生物學檢測。

用戶：嗯，PCR，我知道了，謝謝。

昊諾斯嘉賓：不客氣。一般的組織核酸抽提試劑盒中，都會有一部勻漿的步驟。

昊諾斯嘉賓：以前沒有研磨儀的時候都是用研缽手工勻漿，一天幾十上百個樣品，累成狗。

用戶：研磨如果用液氮處理，里面的液體不會凍住嗎？

用戶：我也有這個疑問，看來這個儀器是核酸分析必須的。

昊諾斯嘉賓：開始會凍住，等研磨到一定時間就自然解凍了，我們處理時只是讓它預冷一下，最好不要凍住。所以一般是放在-80度冰箱稍預冷一下就可以了

用戶：嗯！

用戶：謝謝

昊諾斯嘉賓：是的，核酸檢測必備。

用戶：早些天我看一個打沙棘的視頻，凍掉以后，直接就打下來了，所以冷凍還是有效果的，原理是一樣的。

昊諾斯嘉賓：還要講一下，選質量好的EP管，現在一些國產的EP管質量太差，蓋不嚴，導致液體漏出。如果預冷的話，一些EP管就可能被打碎了，我們有過這樣的例子。

用戶：我們也因為質量不好的EP管影響過實驗，所以試劑耗材也很重要。

昊諾斯嘉賓：同意。

用戶：一定要選擇質量有保證的產品。

昊諾斯嘉賓：是啊。關于振動頻率說明一下，我們選的頻率比較高，我看到有的資料上講一般動物樣品如大腦、心臟、肺、胃、肝臟等無骨骼組織的研磨推薦頻率是1000-1100r/min研磨時間是1-2min，具體的頻率可根據樣品材料及數量的不同，做適當的調整。過大的頻率或者時間都可能會導致部分DNA的斷裂，建議每次研磨時間在1mm左右，中間停頓一會，重復2-3次。

用戶：謝謝袁老師。

最后，讓我們共同期待第18期“組織研磨和樣品處理分享、討論”活動吧！下期，我們不見不散！

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